劉青濤， 李 銀， 劉 娜,2， 楊 婧， 韓凱凱， 劉宇卓， 趙冬敏， 黃欣梅， 田宇杰,3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院, 江蘇 南京 210095; 3.貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025)

H9N2亞型禽流感病毒(AIVs)，屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒屬中的A型流感病毒。H9N2 AIVs于1966年首次分離于北美洲的火雞中[1]，目前在歐亞、北非一些國家的家禽中廣泛流行。中國自1992年在雞群中首次發(fā)現(xiàn)H9N2 AIVs后，該病毒在家禽中迅速擴散，目前已發(fā)展為流行性病毒，是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染性病原之一[2-5]。近年來，對于H9N2亞型禽流感病毒的研究主要集中在病毒的分離鑒定,遺傳進化分析，與H5亞型和H7亞型禽流感病毒的遺傳進化關(guān)系，跨物種傳播風險評估等方面，并取得了一定的進展。但關(guān)于H9N2 AIVs對于家禽致病機理方面的研究卻很少。

H9N2 AIVs HA蛋白的裂解位點僅有1個或者2個不連續(xù)的堿性氨基酸，是一種低致病性的禽流感病毒，H9N2 AIVs感染只能引起雞的輕微呼吸道癥狀[6]。但是，H9N2 AIVs感染能夠?qū)е麓竽c桿菌、雞毒支原體和雞傳染性支氣管炎病毒等病原的繼發(fā)感染，從而引起明顯的雞呼吸道癥狀或者死亡[7]；H9N2 AIVs感染可以加重一些弱毒活疫苗的臨床副反應(yīng)[8]，值得注意的是，H9N2 AIVs感染還可導致雞群的疫苗免疫失敗。以上現(xiàn)象均說明H9N2 AIVs感染可以誘發(fā)雞的免疫抑制，但是目前對于H9N2 AIVs的免疫抑制機制還不清楚。因此，本研究通過評估H9N2 AIVs感染對于雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗免疫應(yīng)答的影響，探索H9N2 AIVs的免疫抑制機制，為雞群中H9N2 AIVs有效防控措施的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

H9N2亞型禽流感病毒1204株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所分離并保存。SPF種蛋購自北京梅里亞公司，孵化后養(yǎng)至21日齡用于試驗。

1.2 儀器和試劑

淋巴細胞刺激抗原為純化的雞新城疫病毒(NDV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)，由本試驗室保存。雞新城疫病和傳染性支氣管炎血凝抑制抗原由本試驗室保存。雞外周血淋巴細胞分離試劑盒購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，鼠抗雞CD3-FITC熒光抗體、鼠抗雞CD4-FITC熒光抗體、鼠抗雞CD8a-FITC熒光抗體為Southern Biotech公司產(chǎn)品，雞IL-4和IFN-γELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,檢測淋巴細胞增殖活性的CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 SPF雞的感染與免疫

將21日齡的SPF雞分為2組，每組6只。病毒感染組通過滴鼻途徑感染H9N2 AIVs，感染劑量為每只1×106.0EID50，對照組同時通過滴鼻途徑接種PBS。病毒感染組和對照組均在接種后5 d，通過滴鼻途徑進行雞新城疫和傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的免疫。以上試驗均在負壓條件下的隔離器內(nèi)進行。

1.4 血清中血凝抑制抗體的測定

疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d，通過翅靜脈采血，分離血清，用β微量法測定血清中抗NDV和IBV的血凝抑制(Haemagglutination inhibition, HI)抗體，計算每組HI抗體滴度的平均值。

1.5 雞外周血T淋巴細胞亞群的流式測定

無菌采集雞外周EDTA抗凝血，按照雞淋巴細胞分離試劑盒的程序進行雞外周血淋巴細胞的分離。將分離的淋巴細胞用PBS洗2遍，并將細胞濃度調(diào)整至1 ml 1×106，每200 μl細胞加入鼠抗CD3、CD4和CD8熒光抗體各2 μl進行染色，室溫孵育40 min后用PBS洗2遍，最后將細胞用含1%小牛血清的PBS定容至200 μl。24 h內(nèi)上機測定CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴細胞的比率。

1.6 雞外周血T淋巴細胞抗原特異性刺激指數(shù)的測定

經(jīng)淋巴細胞分離液分離得到淋巴細胞，并用尼龍毛柱過濾法對T淋巴細胞進行分離。將T淋巴細胞的濃度用RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整為1 ml 2×106，加入96孔板，每孔100 μl，然后在相應(yīng)的孔中加入含NDV、IBV或者刀豆蛋白A (Concanavalin A, ConA)刺激物的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μl，3種刺激物的終含量分別為每孔1×107EID50、1×106EID50和2 μg。同時設(shè)含有淋巴細胞但只加入RPMI 1640培養(yǎng)基的空白對照孔，以及無淋巴細胞只加培養(yǎng)液的本底對照孔。將96孔板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后每孔加入20 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3.5 h，最后在酶標儀上讀取D450值。不同刺激物對T細胞的刺激指數(shù)( Stimulation index, SI)計算公式為:SI= (刺激物D450值-本底對照D450值)/(空白對照D450值-本底對照D450值)。

1.7 雞血清中細胞因子的測定

疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d，通過翅靜脈采血，分離血清，分別用雞IL-4和IFN-γ ELISA檢測試劑盒對血清中的IL-4和IFN-γ進行檢測。試驗操作按試劑盒說明書進行。

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行One-Way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 H9N2 AIVs感染對雞新城疫和傳染性支氣管炎HI抗體的影響

將對照組與感染組于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分別進行NDV和IBV血清HI抗體的測定。NDV HI抗體的測定結(jié)果(圖1)顯示，對照組在疫苗免疫后第7 d其NDV的HI抗體滴度為4.3,第14 d和21 d達到較高水平，分別為6.3和6.6。感染組在疫苗免疫后第7 d的NDV HI抗體滴度為3.3，第14 d和21 d的抗體滴度分別為5.6和6.3，抗體水平均低于對照組，但差異不顯著。IBV HI抗體的測定結(jié)果(圖1)顯示，對照組在疫苗免疫后第7 d其IBV的HI抗體滴度為3.3，第14 d和21 d達到較高水平，分別為4.3和4.6。感染組在免疫后第7 d、14 d和21 d的抗體滴度均低于對照組，但差異不顯著。

圖1 雞血清中雞新城疫病毒(A)和傳染性支氣管炎病毒(B)HI抗體的效價Fig.1 HI antibody titers to newcastle disease virus(A) and infectious bronchitis virus(B) vaccine in chicken serum

2.2 H9N2 AIVs感染對雞外周血中CD4+T淋巴細胞比率和CD8+T淋巴細胞比率的影響

將對照組與感染組于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分別進行外周血淋巴細胞的分離，并用流式細胞儀進行T淋巴細胞的分型測定。對于CD4+T淋巴細胞的測定結(jié)果(圖2)顯示，對照組在免疫后7 d外周血中CD4+ T淋巴細胞的比率為31.19%，第14 d升至33.84%，第21 d達到高峰，CD4+ T淋巴細胞的比率為37.83%。感染組雖然在疫苗免疫后CD4+ T淋巴細胞比率的變化趨勢與對照組相似，但感染組在免疫后第7 d、14 d和21 d的CD4+ T淋巴細胞比率均低于對照組，其中在免疫后第7 d和14 d的差異達到顯著水平(P<0.05)。而對于CD8+T淋巴細胞的測定結(jié)果(圖2)顯示，對照組在免疫后7 d外周血中CD8+ T淋巴細胞的比率為17.14%，第14 d升至19.75%，第21 d達到高峰，CD8+ T淋巴細胞的比率為20.92%。感染組在疫苗免疫后第7 d的CD8+ T淋巴細胞比率為17.97%，略高于對照組，而在免疫后第14 d其CD8+ T淋巴細胞比率出現(xiàn)輕微下降，并且顯著低于對照組(P< 0.05)，免疫后第21 d感染組的CD8+ T淋巴細胞比率雖然升至18.77%，但仍然顯著低于對照組(P<0.05)。

*表示與對照組相比差異達顯著水平(P<0.05)。圖2 雞外周血中T淋巴細胞的亞型比率分析Fig.2 Assay of proportion of T lymphocyte sub-populations in peripheral blood of chicken

2.3 H9N2 AIVs感染對雞外周血T淋巴細胞增殖活性的影響

將對照組與感染組于疫苗免疫后第21 d分別進行外周血T淋巴細胞的分離，分別以ConA、NDV和IBV為刺激物，用CCK-8試劑盒對T淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)進行測定。結(jié)果(圖 3)顯示，當以有絲分裂原ConA為刺激物時對照組的SI值為1.95，而感染組的SI值為1.80，但對照組與感染組之間差異并不顯著。當以NDV或者IBV為免疫刺激物時，對照組的SI值分別為1.9和1.83，而感染組的SI值分別為1.57和1.6，顯著低于對照組。

ConA：刀豆蛋白A；NDV：雞新城疫病毒；IBV：雞傳染性支氣管炎病毒。*表示與對照組相比差異達顯著水平(P<0.05)。圖3 雞外周血中T淋巴細胞刺激指數(shù)分析Fig.3 Assay of stimulation index of T lymphocytes in peripheral blood of chicken

2.4 H9N2 AIVs感染對血清中IL-4和IFN-γ應(yīng)答水平的影響

將對照組與感染組于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分別進行血清中細胞因子IL-4和IFN-γ含量的測定。對于IL-4的測定結(jié)果(圖4)顯示，對照組在免疫后7 d血清中IL-4含量為217 pg/ml，第14 d和21 d分別為282 pg/ml和299 pg/ml。感染組在免疫后第7 d、14 d和21 d血清中IL-4含量均低于對照組，但其差異并不顯著。IFN-γ的測定結(jié)果(圖4)顯示，對照組在免疫后第7 d和14 d血清中IFN-γ含量分別12.39 pg/ml和13.1 pg/ml，第21 d達到高峰，IFN-γ含量為14.41 pg/ml。感染組在免疫后第7 d、14 d和21 d血清中IFN-γ含量分別為11.02 pg/ml、11.59 pg/ml和13.23 pg/ml，顯著低于對照組(P<0.05)。

*表示與對照組相比差異達顯著水平(P<0.05)。圖4 雞血清中細胞因子IL-4和IFN-γ水平Fig.4 Assay of cytokines IL-4 and IFN-γ levels in chicken serum

3 討 論

H9N2 AIVs感染的一個主要危害是引起雞的免疫抑制，進而導致雞群的疫苗免疫失敗或者繼發(fā)感染，但是目前對于H9N2 AIVs的免疫抑制機理仍不清楚。因此，本研究通過分析H9N2 AIVs感染對于雞新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒活疫苗免疫效果的影響，對該病毒感染雞的免疫抑制機理進行了初步研究。

體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的2個主要方面，也是評價疫苗免疫效果的2個主要指標。對于體液免疫應(yīng)答的研究結(jié)果顯示，H9N2 AIVs感染雞后可以降低雞血清中針對雞新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的抗體應(yīng)答，但與對照組相比其差異并不顯著。盡管如此，我們認為H9N2 AIVs感染對于疫苗體液免疫應(yīng)答的影響仍然不應(yīng)該被忽視。因為在集約化的高密度養(yǎng)殖中，氨氣濃度過大和溫度變化等環(huán)境因素可能會加重H9N2 AIVs感染對于雞體免疫機能的損害[9-12]，進而促進H9N2 AIVs感染對于疫苗體液免疫應(yīng)答的抑制作用，造成雞群的疫苗免疫失敗。

由于以前家禽免疫學知識和相關(guān)試劑的缺乏，對于家禽疫苗免疫效果的評價主要以體液免疫應(yīng)答為主，而對于疫苗免疫所產(chǎn)生的細胞免疫應(yīng)答被人們所忽視。但是，隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，對于細胞免疫應(yīng)答在疫苗免疫應(yīng)答中的作用有了更加深入的認識，特別是目前雞的相關(guān)免疫學試劑已經(jīng)逐步健全，因此細胞免疫應(yīng)答已經(jīng)成為除抗體應(yīng)答外另一個評價疫苗免疫效果的重要指標[13-14]。而本研究對于雞外周血T淋巴細胞亞型測定和抗原特異性刺激指數(shù)的測定結(jié)果顯示，H9N2 AIVs感染降低了雞疫苗免疫后的CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞應(yīng)答反應(yīng)。

為了進一步研究H9N2 AIVs感染對于疫苗免疫應(yīng)答的影響，本研究對血清中的IL-4和IFN-γ水平進行了測定。IL-4是一種Th2型細胞因子，可以誘導輔助性T細胞(Th)向Th2方向分化，并且還可以促進B細胞的增殖和抗體分泌，對體液免疫應(yīng)答具有促進作用[15-17]，其含量是評價體液免疫應(yīng)答水平的主要指標。本研究結(jié)果顯示，H9N2 AIVs感染可降低雞在疫苗免疫后血清中的IL-4水平，說明H9N2 AIVs感染確實在一定程度上降低了雞的體液免疫應(yīng)答能力。IFN-γ是一種Th1型細胞因子，能夠活化巨噬細胞，可增加多種細胞表面MHC I類和II類分子的表達，并且可以抑制病毒的復制[18-20]，其含量是評價細胞免疫應(yīng)答水平的主要指標。本研究中，H9N2 AIVs感染明顯降低了雞在新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒疫苗免疫后血清中的IFN-γ水平，說明H9N2 AIVs感染可顯著降低雞對這些疫苗的細胞免疫應(yīng)答能力。

病毒感染動物后可以通過多種方式抑制機體的免疫功能。對于H5N1和H7N9亞型禽流感病毒和1918西班牙H1N1大流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染可引起人、動物血液或者組織中的“炎性因子風暴”，導致體內(nèi)的免疫應(yīng)答失衡和免疫器官損傷，造成免疫抑制[21-25]。Smed-Sorensen等對H1N1亞型人季節(jié)性流感病毒的研究結(jié)果顯示，H1N1病毒能夠感染樹突狀細胞，并且使樹突狀細胞的抗原提呈能力下降[26]。Kodihalli等對H6N1亞型禽流感病毒的研究結(jié)果顯示，病毒能夠感染肺巨噬細胞，抑制巨噬細胞的吞噬功能和殺滅病原微生物[27]。而對H9N2亞型禽流感病毒的研究結(jié)果顯示，病毒感染可以使雞脾臟、胸腺、法氏囊中的細胞凋亡率升高，引起法氏囊部分濾泡髓質(zhì)區(qū)內(nèi)淋巴細胞的輕度減少，但外周血淋巴細胞的數(shù)量并未受到病毒感染的影響[28-29]。本研究結(jié)果顯示H9N2 AIVs感染可以降低雞的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答能力，并且對于細胞免疫應(yīng)答的抑制作用更加顯著，但這是否與病毒感染引起的細胞凋亡或者樹突狀細胞和巨噬細胞的免疫功能調(diào)整、變化相關(guān)還需要進一步研究。

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