張 娜， 楊 雙， 童 非， 朱陽春， 范如芹， 盧 信， 劉麗珠， 穆春生，張振華

(1.江蘇省農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所，江蘇 南京 210014; 2.江蘇省農業(yè)科學院，省部共建國家重點實驗室培育基地江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇 南京 210014; 3.東北師范大學草地科學研究所植被生態(tài)教育部重點實驗室，吉林 長春 130024； 吉林省延邊朝鮮族自治州敦化市草原站，吉林 敦化 133700)

重金屬污染在全球范圍內已經成為一個嚴重問題。有研究者報道，土壤中重金屬含量可高達1.0×105mg/kg[1]，鉛是最具有毒性的污染物之一。鉛污染主要是由人類活動所造成，來源于尾礦和鉛礦開采、煤燃燒、化肥、農藥、電池、鉛砷酸鹽和工業(yè)廢水，另一主要來源是汽車尾氣排放。特別是在發(fā)展中國家，隨著汽車數量增加，鉛大量排放。盡管有些國家已不再使用含鉛汽油，但是鉛極其穩(wěn)定，會長期存留在土壤中[2]。鉛能夠被植物根吸收并對植物產生一定的危害，例如抑制種子發(fā)芽，干涉營養(yǎng)元素吸收和轉運,抑制葉綠素合成和光合作用，引起酶活性改變、膜脂過氧化，對植物的生理和代謝產生不良影響，導致植物生長和發(fā)育受阻，甚至死亡[3-8]。

當處于不利或脅迫環(huán)境時，植物會利用體內的抗氧化系統產生更多的抗氧化物或酶來抵抗氧化脅迫。鉛污染能夠誘導植物體內產生活性氧類(ROS)，主要包括羥自由基(OH-)、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離基(O2·-)等[9]。一定量的ROS是誘導抗氧化回應的一種信號分子，可導致植物體內過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等各種抗氧化酶的活性增強，因此由重金屬誘導的活性氧可能會被抵消、轉換和清除。然而，當植物遭受嚴重脅迫時，體內可能產生過多的ROS，當自由基達到一定量時，植物體內丙二醛(MDA)的含量就會增加，可能導致膜損傷和抗氧化酶破壞。有研究結果表明，隨著重金屬濃度升高植物抗氧化酶活性增強[5,7-8]，這在很多脅迫環(huán)境中均會發(fā)生[10-12]，因為抗氧化酶是植物抵抗氧化脅迫的一種有效機制。然而也有研究結果表明，高濃度重金屬導致抗氧化酶活性顯著降低，因為當植物體內由重金屬誘導的ROS達到一定量時，抗氧化酶受到破壞[13-15]。因此，受脅迫期間植物體內氧化和抗氧化之間的平衡對于植物的適應或抵抗外界干擾及最終存活發(fā)揮重要作用。

蘆葦是典型的濕地植物，能夠忍耐極端環(huán)境，如洪水、干旱和重金屬污染[16-17]。因此，蘆葦被廣泛應用于濕地建設和恢復，處理有重金屬污染的城市和工業(yè)廢水、沉積物以及尾礦污染。有研究結果表明，蘆葦抵抗重金屬的防御機制主要是依賴抗氧化酶活性清除活性氧[18]。然而，目前有關不同生境蘆葦抗氧化脅迫的能力是否存在差異還不清楚。因此，本研究擬探究淹水和干旱條件下，鉛污染對蘆葦體內蛋白質、MDA含量以及抗氧化酶活性的影響，評估兩種不同生境蘆葦對鉛污染的耐受或抵抗能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料準備

蘆葦種子采自生長在吉林省長春市西部濕地的野生蘆葦。試驗用土采自吉林省長嶺縣東北師范大學試驗站草地 0～20 cm表層土壤。土壤全氮和有機碳含量分別為6.9%和1.6%，pH值8.6，電導率91 μs/cm，最大田間持水量為200 g/kg。將一定濃度的Pb (NO3)2溶液均勻拌入風干并過1 mm篩的土壤，使污染土壤中全鉛的目標含量分別為0 mg/kg、500 mg/kg、1 500 mg/kg、3 000 mg/kg和4 500 mg/kg。將拌勻的每份污染土裝入底部封閉的花盆(內徑30 cm，高35 cm)。將裝有污染土的花盆避光溫育45 d。同時，從各處理中取出少量污染土測定各污染土中鉛的實際含量，測定結果表明對照土和4個濃度梯度的人工污染土中鉛的含量分別為12.9 mg/kg、562.0 mg/kg、1 574.0 mg/kg、3 812.0 mg/kg、4 750.0 mg/kg。

1.2 試驗設計

將播種后45 d約 3～4葉并高度一致的蘆葦幼苗，移栽至裝有污染土的花盆中，每盆20株。用遮陽布避光緩苗5 d后進行間苗，每盆保留10株。然后進行淹水和干旱處理，分別模擬蘆葦的水生和干旱生境。每天下午16∶00澆水，淹水處理花盆中保持水層高出污染土表面 3～5 cm，干旱處理花盆中土壤含水量保持在田間持水量的 50%±5%。采用裂區(qū)試驗設計，水分為主區(qū)包括水層和干旱2個水平，鉛濃度為副區(qū)包括5個水平，共10個處理，每個處理12個重復。整個試驗在東北師范大學校園避雨棚內進行，試驗時間90 d。

1.3 測定方法

分別在處理的第60 d和90 d，從每株蘆葦上取頂端第1個完全展開的葉片，用保鮮膜包裹立即放入液氮中，約30 min后轉移至-80 ℃冰箱中保存。取冷凍葉片0.3 g，剪成1 cm長的碎片，加入5 ml提取液(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.0，含1 mmol/L EDTA-Na2，1%聚乙烯吡咯烷酮)，然后在液氮條件下研磨提取蛋白質和酶。

酶活性測定按照李忠光等的方法[19]，并做適當修改。過氧化氫酶(CAT)活性測定反應混合液為50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，內含0.1 mmol/L EDTA。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定反應混合液為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.8，內含0.1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L NBT、13.37 mmol/L蛋氨酸。過氧化物酶(POD)活性測定反應混合液為50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，內含0.1 mmol/L EDTA、10 mmol/L愈創(chuàng)木酚和5 mmol/L H2O2。

可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250染色法[20]測定，丙二醛(MDA)含量采用TBA(硫代巴比妥酸)染色法[20]測定。

1.4 統計分析

對2次測定的可溶性蛋白質含量、酶活性和丙二醛含量進行重復測量分析，分析不同脅迫時間內這些參數對不同濃度鉛和水分變化的響應。脅迫時間(60 d、90 d)作為組內因子，鉛濃度和水分作為組間固定因子。重復測量中，當鉛濃度和水分存在顯著作用時，進行單因素方差分析和獨立樣本t檢驗。采用單因素方差分析法，分析不同水分條件下鉛的作用，鉛濃度作為固定因子。采用獨立樣本t檢驗，分析不同鉛濃度水平上水分的作用，水分作為固定因子。在進行單因素方差分析時，對于不符合正態(tài)分布和方差齊性的數據進行轉換。所有用數據使用SPSS17.0(SPSS Inc., Chicago, USA)分析，所有圖用Sigmaplot 10.0 (Systht Software, Inc., San Jose, CA, USA)制作。

2 結 果

2.1 鉛污染、淹水及脅迫時間對蘆葦體內丙二醛含量的影響

鉛污染、淹水及脅迫時間對蘆葦體內丙二醛含量均有顯著影響(表1)。在淹水條件下，隨著鉛濃度升高蘆葦中丙二醛含量呈增加趨勢，大于1 500 mg/kg的鉛污染均導致丙二醛含量顯著增加。干旱條件下，脅迫處理60 d，3 000 mg/k鉛污染處理蘆葦體內丙二醛含量顯著增加；脅迫處理90 d，4個不同濃度鉛污染處理均導致丙二醛含量顯著增加。同一鉛濃度水平上，脅迫處理60 d，淹水處理蘆葦丙二醛含量大于干旱處理，而脅迫處理90 d的結果則相反(圖1)。

表1鉛、水分及其交互作用對蘆葦丙二醛、可溶性蛋白質含量及各種抗氧化酶活性影響的方差分析結果

Table1ANOVAresultsoftheeffectsofPb,waterandtheirinteractiononthecontentsofmalondialdehyde(MDA)andsolubleprotein,andantioxidantenzymeactivitiesofPhragmitesaustralis

參數PbFPb×FTT×PbT×FT×Pb×F丙二醛含量??????ns????????ns蛋白質含量ns?????????nsns過氧化氫酶活性??????nsnsns超氧化物歧化酶活性?????????????????過氧化物酶活性?????????????????????

Pb代表鉛污染處理，F代表淹水處理，T代表處理時間。*、**、***分別表示P≤0.05、P≤0.01和P≤0.001，ns表示不顯著。

同一淹水或干旱處理水平上不同小寫字母表示不同鉛濃度處理間存在顯著差異。圖1 處理后60 d (A) 和90 d (B)鉛污染對蘆葦體內丙二醛含量的影響Fig.1 The effects of Pb contamination on MDA content of Phragmites australis after 60 d (A) and 90 d (B) of treatments

2.2 鉛污染、淹水及脅迫時間對蘆葦體內可溶性蛋白質含量的影響

淹水和脅迫時間及鉛污染和淹水的交互作用均顯著影響蘆葦總可溶性蛋白質含量，而鉛污染的影響不明顯(表1)。淹水條件下，脅迫60 d和90 d蘆葦體內總可溶性蛋白質含量隨著鉛濃度升高呈增加趨勢，且脅迫90 d時500 mg/kg以上鉛即可導致可溶性蛋白質含量顯著增加。干旱條件下，脅迫60 d，最高濃度鉛(4 500 mg/kg)導致蘆葦體內可溶性蛋白質含量顯著減小，而脅迫90 d，鉛濃度升高雖導致可溶性蛋白質含量增加，但均未達到顯著水平。在高濃度鉛處理水平上，淹水處理蘆葦的可溶性蛋白質含量顯著大于干旱處理(圖2)。

同一淹水或干旱處理水平上不同小寫字母表示不同鉛濃度處理間存在顯著差異。圖2 處理后60 d (A) 和90 d (B)鉛污染對蘆葦體內可溶性蛋白質含量的影響Fig.2 The effects of Pb contamination on soluble protein content of Phragmites australis after 60 d (A) and 90 d (B) of treatments

2.3 鉛污染、淹水及脅迫時間對蘆葦體內過氧化氫酶活性的影響

淹水和脅迫時間及鉛污染與淹水的交互作用對過氧化氫酶(CAT)活性均產生顯著影響(表1)。淹水條件下，脅迫60 d，4個鉛濃度處理蘆葦的CAT活性均顯著升高；脅迫90 d，隨著鉛濃度增加CAT活性呈增加趨勢但不顯著。干旱條件下，脅迫60 d和90 d，CAT活性具有相似的變化趨勢，即隨著鉛處理濃度升高CAT活性先增加后下降，即500 mg/kg和1 500 mg/kg鉛水平上顯著增加，而后減小(圖3)。

同一淹水或干旱處理水平上不同小寫字母表示不同鉛濃度處理間存在顯著差異。圖3 處理后60 d (A) 和90 d (B)鉛污染對蘆葦體內過氧化氫酶活性的影響Fig.3 The effects of Pb contamination on CAT activity of Phragmites australis after 60 d (A) and 90 d (B) of treatments

2.4 鉛污染、淹水及脅迫時間對蘆葦體內超氧化物歧化酶活性的影響

鉛污染、淹水和二者交互作用及脅迫時間對超氧化物歧化酶(SOD)活性均產生顯著影響(表1)。淹水條件下，脅迫60 d，隨著鉛處理濃度升高SOD活性顯著增加；脅迫90 d，SOD活性呈先增加后減小的趨勢，但4個鉛濃度處理SOD活性均大于對照。干旱條件下，脅迫60 d和90 d，隨著鉛處理濃度升高SOD活性顯著增加。在同一鉛濃度水平上，脅迫60 d，淹水處理的SOD活性顯著小于干旱處理，而脅迫90 d，則是淹水處理顯著大于干旱處理(圖4)。

同一淹水或干旱處理水平上不同小寫字母表示不同鉛濃度處理間存在顯著差異。圖4 處理后60 d (A) 和90 d (B)鉛污染對蘆葦體內超氧化物歧化酶活性的影響Fig.4 The effects of Pb contamination on SOD activity of Phragmites australis after 60 d (A) and 90 d (B) of treatments

2.5 鉛污染、淹水及脅迫時間對蘆葦體內過氧化物酶活性的影響

鉛污染、淹水和二者交互作用及脅迫時間對過氧化物酶(POD)活性均產生顯著影響(表1)。淹水條件下，脅迫60 d，高濃度鉛(3 000 mg/kg和4 500 mg/kg)導致POD活性顯著增加；脅迫90 d，隨著鉛濃度升高POD活性呈先增加后減小的趨勢，但均大于對照。干旱條件下，脅迫60 d高濃度鉛導致POD活性顯著增加，與淹水處理的變化趨勢相同；脅迫90 d，POD活性隨著鉛濃度升高而增加，且3 000 mg/kg鉛處理的酶活性顯著增加。在同一鉛濃度水平上，脅迫60 d干旱處理的POD活性大于淹水處理，且在最高鉛濃度下達到顯著水平；脅迫90 d淹水處理蘆葦的POD活性則顯著大于干旱處理(圖5)。

同一淹水或干旱處理水平上不同小寫字母表示不同鉛濃度處理間存在顯著差異。圖5 處理后60 d (A) 和90 d (B)鉛污染對蘆葦體內過氧化物酶活性的影響Fig.5 The effects of Pb contamination on POD activity of Phragmites australis after 60 d (A) and 90 d (B) of treatments

3 討 論

重金屬與鹽堿、干旱等其他環(huán)境脅迫因子相似，可能直接或間接地導致植物體內活性氧類(ROS)含量增加，使植物細胞膜、蛋白質甚至DNA遭受氧化性損傷[11-12]。為了適應脅迫并存活，植物體內常常產生抗氧化酶和特定代謝物抵消、轉換和清除重金屬誘導的ROS以抵抗氧化脅迫。然而，當植物體內由重金屬誘導的ROS含量達到一定量時，也可能導致抗氧化酶受到破壞[5,7-8]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化產生的一種有毒物質，因此它被認為是自由基產生并可能導致組織受損的一種指示物[9]。本研究中，在淹水和干旱條件下，隨著鉛濃度和時間的增加，MDA含量均顯著增加，說明隨著脅迫時間的延長鉛誘導蘆葦體內產生的氧化脅迫增強，這與先前很多學者的觀點[5,14-15]相同。有研究結果表明，干旱導致植物中MDA含量顯著增加，膜脂過氧化作用增強[11,19]。Bauddh等研究發(fā)現，干旱和鎘復合脅迫使蓖麻(Ricinuscommunis)和芥菜(Brassicajuncea)中的MDA含量均大于干旱和重金屬單獨脅迫處理[20]。同樣，我們也發(fā)現，在脅迫90 d，干旱和鉛處理對植物產生了更強的氧化脅迫，因為在脅迫90 d干旱處理蘆葦MDA含量顯著大于淹水處理。因此，在鉛污染和干旱條件下蘆葦遭受更強的氧化脅迫，可能是顯著抑制蘆葦生長的原因之一。

重金屬對植物產生的脅迫，可以通過可溶性蛋白質含量來衡量，同時可溶性蛋白質含量的變化也體現了植物對重金屬的抗性。有學者認為，植物體內可溶性蛋白質含量與重金屬濃度呈負相關，隨著重金屬濃度升高植物體內可溶性蛋白質含量降低[21]。相反，也有研究結果表明隨著重金屬濃度的升高，植物體內可溶性蛋白質含量升高[22]。張雯對二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的研究結果表明，低濃度鎘導致植物體內可溶性蛋白質含量升高，而高濃度鎘則導致植物體內可溶性蛋白質含量顯著降低[23]。本研究中，淹水條件下隨著鉛濃度的升高，蘆葦體內可溶性蛋白質含量增加。這可能是因為逆境下抗氧化酶活性增強，蘆葦體內產生更多的可溶性蛋白質與鉛離子絡合來降低鉛對植物的毒性。然而，干旱條件下脅迫60 d，鉛處理蘆葦體內可溶性蛋白質含量呈減小趨勢，脅迫90 d則呈增加趨勢。這可能是因為干旱脅迫初期蘆葦體內可溶性蛋白質比較敏感，鉛脅迫促進植物體內蛋白質的分解，而隨后植物體內產生鉛離子結合蛋白以降低鉛的毒性?？梢?，蘆葦體內可溶性蛋白質含量與外界水分變化也有一定關系。

抵抗ROS的酶主要包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等，它們在抵消、轉換和清除由鉛誘導的活性氧中發(fā)揮重要作用。CAT和SOD主要抵抗過氧化反應，清除有毒的過氧化物。過氧化氫能夠被CAT直接清除，轉化成水和氧氣[2,5,7]。本試驗中，淹水60 d蘆葦體內CAT活性隨著鉛處理濃度的升高而顯著增加。說明蘆葦對鉛脅迫產生了有效的抵抗作用，這種抵抗機制在其他脅迫中也存在[10-12]。然而，在脅迫90 d，CAT活性雖然增加但不顯著。說明在水和鉛脅迫后期蘆葦依靠CAT清除過氧化氫的抵抗幾乎不起作用。有研究結果表明，鉛污染、鹽堿以及干旱等脅迫均導致CAT活性減小[12-14]，但是本研究中干旱條件下小于3 000 mg/kg的鉛污染處理的蘆葦始終可以通過CAT清除過氧化氫。

SOD是植物抗氧化酶防御系統的重要組成部分，它能夠將超氧陰離子自由基(O2·-)轉化為過氧化氫和氧氣[24]。在所有抗氧化酶中SOD活性對于植物抗氧化系統的維持更為重要[25]。有研究者報道，在鹽堿、淹水以及重金屬(如Cd、Pb和Al)污染環(huán)境中，植物體內SOD活性升高[11-12,14]。這與本研究結果相似，鉛污染濃度升高導致SOD活性顯著增加。然而Islam 等研究發(fā)現，隨著鉛處理濃度增加紫花香薷(Elsholtziaargyi)SOD活性顯著減小[5]。這可能是因為當植物體內由重金屬誘導的ROS含量達到一定量時，酶蛋白失活，酶合成減少或者酶亞基裝配發(fā)生改變使抗氧化酶受到破壞[6,13]。本研究中，鉛處理導致蘆葦SOD活性增強，而且淹水條件下隨著脅迫時間的延長SOD活性升高，但干旱條件下隨著脅迫時間的延長SOD活性減小。因此，在淹水和干旱環(huán)境中SOD在抵抗鉛誘導的氧化脅迫中均發(fā)揮重要作用，隨著脅迫時間的延長，水生境蘆葦具有較強的抵抗力。

POD主要是通過結合抗氧化物(作為給電子體)間接地清除過氧化氫[14-15]。它在細胞內外均有分布，例如細胞質、細胞壁、液泡以及細胞外孔隙。在很多脅迫環(huán)境中均發(fā)現POD活性增加，例如重金屬(Al、Cu、Cd、Zn、Pb)、水、鹽堿和寒冷等脅迫[5,11,26]。相反，也有研究結果表明，高濃度重金屬如Pb、Zn和Cu等污染導致植物體內POD活性顯著減小[5]。本研究發(fā)現，淹水和干旱條件下隨著鉛處理濃度升高POD活性增強。因此，在淹水和干旱環(huán)境中POD在抵抗鉛誘導的氧化脅迫中均發(fā)揮重要作用。此外，高濃度(3 000 mg/kg和4 500 mg/kg)鉛污染處理蘆葦的POD和CAT活性減小，可能是因為過氧化氫和有毒過氧化物的清除過程被延遲，導致膜脂過氧化。

可見，無論是淹水還是干旱條件下，脅迫60 d的蘆葦通過CAT、SOD和POD酶活性增強可以有效地抵抗和防御鉛和淹水誘導的氧化脅迫。脅迫90 d，SOD和POD是抵抗鉛污染引起的氧化脅迫的關鍵酶，但是干旱條件下SOD和POD活性有所減小?？傊?，盡管鉛和淹水導致蘆葦遭受一定的氧化脅迫，但是抗氧化酶可以作為蘆葦內在的防御機制來抵抗鉛脅迫所誘導的氧化損傷，而且在較長時間的脅迫下水生境蘆葦具有較強的抗氧化能力。

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