冷小梅， 譚 峰， 才巧玲， 薛齡季軒， 姜 珊， 李 冬

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)信息技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

水稻是人類賴以生存的主要糧食作物之一，是中國糧食作物生產(chǎn)中不可或缺的一部分[1]。稻瘟病一直是水稻的重要病害之一，每年都有發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn) 40%～50%[2-6]。稻瘟病病菌的生命力極強(qiáng)，它可以在稻草和稻谷上過冬，在合適的環(huán)境下引起稻瘟病的發(fā)生[7]。

水稻稻瘟病檢測常采用近紅外光譜技術(shù)、多光譜成像技術(shù)、高光譜成像技術(shù)和圖像處理等方法。劉飛等[8]、譚峰等[9]應(yīng)用可見近紅外光譜技術(shù)對水稻稻瘟病進(jìn)行快速診斷。張浩等[10]利用多光譜成像技術(shù)對水稻穗頸瘟的嚴(yán)重程度識別進(jìn)行了研究。楊燕[11]利用高光譜成像技術(shù)采集水稻稻瘟病植株圖像，再應(yīng)用數(shù)據(jù)圖像處理方法對得到的稻瘟病圖像進(jìn)行特征提取，建立病害識別模型。袁建清等[12]基于高光譜成像技術(shù)對寒地水稻葉瘟病病征與缺氮病征識別進(jìn)行了研究。近年來，農(nóng)作物病害檢測技術(shù)越來越多樣化[13-14]。但這些檢測技術(shù)實(shí)際操作難度較大，對環(huán)境要求嚴(yán)格，對樣品的要求也非常復(fù)雜[15]。

拉曼光譜技術(shù)是當(dāng)前比較新穎、快捷的一種檢測方法，它既可以檢測有機(jī)物也可以檢測無機(jī)物，對于物質(zhì)的氣態(tài)、固態(tài)、液態(tài)等狀態(tài)要求也不高[16-17]。對于具有相似分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，利用拉曼光譜技術(shù)也可以檢測出他們之間的差異，有效地區(qū)分分子結(jié)構(gòu)之間的不同[18]。因此，本研究采集正常水稻和帶有稻瘟病病菌的水稻植株拉曼光譜數(shù)據(jù)，對比分析有病害與無病害水稻植株細(xì)胞內(nèi)部蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物等的拉曼光譜差異，進(jìn)而建立基于拉曼光譜的稻瘟病診斷方法。

1 材料與方法

2011-2014年從黑龍江省肇源縣二站鎮(zhèn)試驗(yàn)田中采集吉粳88水稻植株樣品，用透明、密封、濕潤的塑料瓶盛裝以避免植株蒸騰失水。

選用DeltaNu公司生產(chǎn)的Advantage532型拉曼光譜儀，采用低功率5 mW配置。對無病害和有病害的水稻莖稈部位進(jìn)行波段為200～3 400 cm-1的光譜采集，水稻莖部的拉曼特征峰敏感段也主要集中在 500～1 700 cm-1。對采集到的水稻莖部拉曼光譜進(jìn)行預(yù)處理之后，利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，計(jì)算出樣品的平均光譜，應(yīng)用繪圖軟件Origin繪制圖形。

對采集到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Matlab編寫的程序處理數(shù)據(jù)，得到樣品光譜的峰值；通過拉曼光譜儀自帶的光譜采集軟件NuSpec software，對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和存檔，數(shù)據(jù)連續(xù)自動(dòng)地存為spc格式，光譜存為原始曲線；對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定量分析，以Grams PLSIQ軟件制作的校正文件直接導(dǎo)入光譜儀軟件中，得到光譜數(shù)據(jù)的多種表征，對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻植株正常莖稈與稻瘟病發(fā)病莖稈的拉曼光譜差異

用拉曼光譜儀采集寒地水稻無病害與有病害植株莖部的 200～3 400 cm-1波段光譜。結(jié)果顯示水稻植株莖部拉曼特征峰敏感段主要集中在 500～1 700 cm-1波段。對采集的數(shù)據(jù)利用Excel軟件進(jìn)行分析，得到水稻植株正常莖稈與稻瘟病發(fā)病莖稈的拉曼光譜整體對比圖(圖1)。

圖1 水稻植株正常莖稈與稻瘟病發(fā)病莖稈的拉曼光譜整體對比圖Fig.1 Overall comparison chart of Raman spectra of normal stems and stems infected by rice blast of rice plants

拉曼特征峰的位移分為紅移和藍(lán)移，紅移表示從高頻率移到低頻率，藍(lán)移表示從低頻率移到高頻率。從圖1中可以看出正常莖稈波數(shù)562 cm-1的拉曼特征峰紅移到發(fā)病莖稈中的556 cm-1處，說明主鏈中酰胺VI的C=O變形能量降低，C=O雙鍵變長且相互作用的雙鍵能力變?nèi)?，同時(shí)也代表蛋白質(zhì)肽鍵變?nèi)酢５鞍踪|(zhì)側(cè)鏈中的苯丙氨酸殘基特征峰由1 615 cm-1藍(lán)移到1 619 cm-1處，使得苯丙氨酸殘基的振動(dòng)能量增加，進(jìn)一步表明發(fā)病莖稈中蛋白質(zhì)的種類、空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。DNA中堿基腺嘌呤特征峰由726 cm-1處藍(lán)移到730 cm-1，說明堿基中的腺嘌呤含量增加，同時(shí)說明DNA中堿基組織成分發(fā)生變化。碳水化合物中單糖拉曼特征峰由1 072 cm-1藍(lán)移到1 076 cm-1，說明葡萄糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸3種單糖中至少有1種單糖的化學(xué)鍵振動(dòng)能量增加，連接的化學(xué)鍵相互作用增強(qiáng)；碳水化合物中的纖維素拉曼特征峰由1 446 cm-1紅移到1 440 cm-1處，說明多糖中纖維素化學(xué)鍵振動(dòng)能量降低，進(jìn)一步證明了稻瘟病發(fā)病莖稈中碳水化合物成分、結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。為了更加清晰地對比分析稻瘟病發(fā)病莖稈與正常莖稈拉曼特征峰數(shù)量的變化，將2株水稻植株拉曼光譜的相對強(qiáng)度進(jìn)行細(xì)化(圖2)。

圖2 水稻植株正常莖稈與稻瘟病莖稈拉曼光譜對比圖Fig.2 The comparison chart of Raman spectra of normal stems and stems infected by rice blast of rice plants

對比圖2中稻瘟病發(fā)病莖稈與正常莖稈的拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)，在642 cm-1處發(fā)病莖稈的拉曼光譜沒有出現(xiàn)波峰，說明此處的酪氨酸特征峰消失了。而發(fā)病莖稈中DNA在1 328 cm-1處的胸腺嘧啶特征峰也消失了，說明胸腺嘧啶發(fā)生了強(qiáng)烈的化學(xué)變化，進(jìn)一步說明稻瘟病病菌的侵染造成水稻組織內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物等分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

從圖3中可以看出，水稻稻瘟病發(fā)病莖稈在527 cm-1處的拉曼特征峰是由發(fā)病葉片中526 cm-1處的特征峰藍(lán)移得到的，說明蛋白質(zhì)側(cè)鏈在此處的S-S鍵振動(dòng)加強(qiáng)，相互作用增強(qiáng)。而稻瘟病發(fā)病莖稈在631 cm-1處的拉曼特征峰是由發(fā)病葉片在636 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的苯丙氨酸殘基的化學(xué)鍵振動(dòng)能量減弱，即殘基間相互作用減弱，進(jìn)一步說明當(dāng)?shù)疚敛〔【秩胨厩o部時(shí)，組織中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常。

圖3 水稻植株稻瘟病發(fā)病葉片和莖稈拉曼光譜的整體對比圖Fig.3 Overall comparison chart of Raman spectra of leaves and stems of rice plants with rice blast

水稻稻瘟病發(fā)病莖稈拉曼光譜中在810 cm-1處存在RNA磷酸二酯PO2的特征峰，然而在發(fā)病葉片光譜中此處的特征峰消失，說明RNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。發(fā)病莖稈在1 099 cm-1處的特征峰是由發(fā)病葉片在1 095 cm-1處的特征峰藍(lán)移得到的，說明DNA中骨架磷酸之間的化學(xué)鍵振動(dòng)能量增強(qiáng)，相互作用增強(qiáng)。也說明隨著稻瘟病病菌的侵染，水稻稻瘟病發(fā)病莖稈中RNA和DNA骨架磷酸發(fā)生變化。發(fā)病莖稈在1 215 cm-1處的拉曼特征峰是由發(fā)病葉片在1 223 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明DNA中堿基腺嘌呤含量減少，化學(xué)鍵之間相互作用減弱。而發(fā)病莖稈在1 583 cm-1處的拉曼特征峰是由發(fā)病葉片在1 586 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明在DNA堿基鳥嘌呤和腺嘌呤中至少有一種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。也進(jìn)一步說明在受到稻瘟病病菌入侵的情況下，DNA中堿基結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。發(fā)病莖稈中在1 111 cm-1處的拉曼特征峰消失，說明此處不存在D-甘露糖。發(fā)病莖稈在1 350 cm-1處的拉曼特征峰是由發(fā)病葉片在 1 356 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明此處葡萄糖和葡萄糖醛酸中至少有一種物質(zhì)的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂。也說明稻瘟病病菌侵染對碳水化合物中單糖的影響。發(fā)病莖稈在1 366 cm-1處的拉曼特征峰是由發(fā)病葉片在1 364 cm-1處的特征峰藍(lán)移得到的，說明此處多糖中的葡聚糖的化學(xué)鍵相互作用增強(qiáng)。發(fā)病莖稈在1 449 cm-1處的拉曼特征峰是由發(fā)病葉片在1 457 cm-1處的特征峰紅移得到的，說明此處纖維素中化學(xué)鍵之間的相互作用減弱，也說明稻瘟病病菌侵染使碳水化合物分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

由圖4可見，發(fā)病葉片在846 cm-1處的拉曼特征峰在發(fā)病莖稈光譜中消失，說明發(fā)病莖稈中酪氨酸的對羥苯基環(huán)化學(xué)鍵全部斷裂。發(fā)病葉片在1 678 cm-1處存在1個(gè)拉曼特征峰，而發(fā)病莖稈在此處存在2個(gè)非常小的拉曼特征峰，說明酰胺Ⅰ中β-折疊化學(xué)鍵振動(dòng)能量變?nèi)?，?折疊化學(xué)鍵之間的相互作用變?nèi)酢膱D4中還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病葉片光譜1 520 cm-1附近僅存在1個(gè)拉曼特征峰，而在發(fā)病莖稈光譜中存在3個(gè)小的拉曼特征峰，說明C=C雙鍵在此處的伸縮振動(dòng)能量十分微弱，化學(xué)鍵斷裂十分嚴(yán)重且化學(xué)鍵之間的相互作用也十分脆弱。

圖4 水稻植株稻瘟病發(fā)病葉片和莖稈拉曼光譜的對比圖Fig.4 Comparison chart of Raman spectra of leaves and stems of rice plants with rice blast

2.2 水稻植株稻瘟病發(fā)病莖稈的拉曼頻率點(diǎn)變化

從500～1 700 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)挑選32個(gè)拉曼頻率點(diǎn)繪制散點(diǎn)圖(圖5)。從圖5中可以看出這32個(gè)拉曼頻率點(diǎn)的變化，整體來說發(fā)病莖稈的拉曼特征峰相對強(qiáng)度更加平穩(wěn)，特別是871 cm-1、1 001 cm-1、1 153 cm-1、1 520 cm-14處的拉曼特征峰值發(fā)生了變化。在871 cm-1處蛋白質(zhì)中的色氨酸的吲哚環(huán)含量降低，說明吲哚環(huán)遭到破壞；在1 001 cm-1處甲基(-CH3)的含量減少，說明-CH3的平面搖擺振動(dòng)幾乎沒有發(fā)生；在1 153 cm-1處C-C單鍵含量減少，并且其右側(cè)半峰1 189 cm-1處的C-N 鍵幾乎全部斷裂；在1 520 cm-1處C=C雙鍵含量減少，且C=C 雙鍵的伸縮振動(dòng)也在減弱。這幾處峰值的變化都充分說明在稻瘟病病菌的侵染下，水稻莖稈內(nèi)蛋白質(zhì)的多級結(jié)構(gòu)和生理功能均出現(xiàn)異常。

圖5 水稻植株稻瘟病發(fā)病莖稈拉曼頻率點(diǎn)散點(diǎn)圖Fig.5 Raman scatter plot of infected stems of rice plants with rice blast

2.3 采用ROC曲線方法診斷水稻稻瘟病

用Spss統(tǒng)計(jì)軟件對稻瘟病發(fā)病莖稈和正常莖稈的拉曼光譜進(jìn)行2個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示有顯著差異(P<0.05)。發(fā)現(xiàn)539 cm-1、793 cm-1、1 055 cm-1、1 364 cm-1特征峰強(qiáng)度(I539 cm-1、I793 cm-1、I1 055 cm-1、I1 364 cm-1)等在正常水稻莖部與稻瘟病發(fā)病組織中差異性不大，而I511 cm-1、I621 cm-1、I969 cm-1、I1 109 cm-1、I1 446 cm-1等在正常水稻莖部與稻瘟病發(fā)病組織中存在明顯差異。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用受試者工作特征曲線(ROC曲線)方法，對比正常水稻莖稈與稻瘟病發(fā)病莖稈拉曼譜線的靈敏度與特異性。如果曲線面積(AUC)>0.6，則說明具有顯著的診斷性，AUC越接近1.0，則說明診斷性越高。選擇7個(gè)具有代表意義的特征峰繪制ROC曲線(圖6)。

圖6中I1 154 cm-1曲線與I1 520 cm-1曲線由橫軸零點(diǎn)直接達(dá)到縱軸的最高點(diǎn)1.00的位置，曲線下的面積AUC=1.00，說明發(fā)病莖稈在1 154 cm-1和1 520 cm-1特征峰處C-C和C=C幾乎全部斷裂，或者說不存在C-C鍵和C=C雙鍵。I523 cm-1曲線在橫軸的0.33和0.67處有2個(gè)折點(diǎn)，曲線下面積AUC=0.86，說明發(fā)病莖稈在此處的S-S鍵變長，S-S鍵的扭曲-扭曲-反式構(gòu)象變?nèi)?。I1 001 cm-1曲線在橫軸的0.67處出現(xiàn)折點(diǎn)，曲線面積AUC=0.97，說明發(fā)病莖稈在此處的甲基(-CH3)化學(xué)鍵斷裂十分明顯。I1 189 cm-1曲線在橫軸的0.33處出現(xiàn)折點(diǎn)，曲線面積AUC=0.94，說明發(fā)病莖稈在此處大部分的C-N鍵斷裂，且C-N鍵的伸縮振動(dòng)十分微弱。I1 556 cm-1曲線在橫軸的0.17、0.33、0.83處出現(xiàn)折點(diǎn)，曲線面積AUC=0.97，說明發(fā)病莖稈在此處的色氨酸吲哚環(huán)之間相互作用的化學(xué)鍵減弱。I1 584 cm-1曲線在橫軸的0.33處出現(xiàn)折點(diǎn)，曲線面積AUC=0.83，說明發(fā)病莖稈在此處的DNA發(fā)生異常，鳥嘌呤和腺嘌呤中至少有1種物質(zhì)發(fā)生改變。

圖6 正常水稻植株與稻瘟病發(fā)病莖稈的ROC曲線Fig.6 Receiver operating characteristic(ROC) curve of normal rice plants and infected stems of rice plants with rice blast

3 結(jié) 論

本研究嘗試將受試者工作特征曲線(ROC曲線)方法應(yīng)用在水稻稻瘟病檢測。首先從蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物方面對水稻莖部拉曼光譜在871 cm-1、1 001 cm-1、1 153 cm-1、1 520 cm-1處進(jìn)行典型峰值的確認(rèn)，根據(jù)C-C鍵、C=C鍵以及C-N鍵等化學(xué)鍵振動(dòng)頻率的不斷減弱，以及DNA分子中腺嘌呤、鳥嘌呤等的結(jié)構(gòu)異常，對水稻莖部進(jìn)行稻瘟病診斷,選擇7個(gè)特征峰繪制ROC曲線，曲線下面積(AUC)最小為0.83，說明診斷性較明顯。其次利用Spss統(tǒng)計(jì)軟件對正常水稻莖稈及稻瘟病發(fā)病莖稈和葉片的拉曼光譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過對比兩者拉曼譜線在位移、峰數(shù)以及相對強(qiáng)度上的變化，判斷稻瘟病發(fā)病水稻植株內(nèi)分子結(jié)構(gòu)的改變，為稻瘟病早期檢測提供依據(jù)。

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