趙園園， 孟金柱

(銅仁學(xué)院烏江學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

miRNAs 通常都是通過(guò)與靶基因 mRNAs 按序列配對(duì)的方式結(jié)合來(lái)抑制靶基因的表達(dá)，由于堿基種類少，種子序列個(gè)數(shù)少(約 8 個(gè)堿基)，所以出現(xiàn)同樣序列的概率極高，因此 miRNAs 與 mRNAs 的配對(duì)是“一對(duì)多，多對(duì)一”的方式[1]，因此 miRNAs 的生物學(xué)功能極其復(fù)雜。探究 miR-27a 與 干細(xì)胞因子(SCF) 的靶向關(guān)系，有助于通過(guò)已知的 SCF 的功能，推測(cè)和探究 miR-27a 生物學(xué)功能，為 miR-27a 功能的研究開(kāi)辟新方向。研究結(jié)果表明，miR-27a 參與多種細(xì)胞的增殖分化、凋亡,血管生成,黑色素生成,脂肪形成等生物學(xué)過(guò)程[2-7]。還與多種癌癥(乳腺癌、胃癌和宮頸癌等)的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[8-11]。而SCF通過(guò)與 c-kit 結(jié)合參與造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和肥大細(xì)胞的遷移、存活及增殖等生物學(xué)過(guò)程[12]。隨著越來(lái)越多的 miRNAs 被發(fā)現(xiàn)，miRNAs 功能的研究及其作用機(jī)理的探究越來(lái)越受到人們的關(guān)注，miRNAs 不編碼蛋白質(zhì)，是通過(guò)作用于靶基因來(lái)發(fā)揮作用的，因此，尋找 miRNAs 的靶基因尤其關(guān)鍵。研究者發(fā)現(xiàn)，在淺色哺乳動(dòng)物皮膚中 miR-27a 表達(dá)量顯著高于深色皮膚[7, 13]，因此，推測(cè) miR-27a 可能作用于促進(jìn)黑色素生成的基因，而SCF在黑色素生成中通過(guò)與 c-kit 結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)作用，因此，本試驗(yàn)假設(shè)SCF基因是 miR-27a 的靶基因之一。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)等，驗(yàn)證miR-27a 與SCF之間是否存在靶向關(guān)系，為進(jìn)一步探究和完善miR-27a的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗(yàn)所用 C57BL/6 小鼠和 HEK 293 T 細(xì)胞及 pMSCV 和 pmirGLO 載體均來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室，分別選 2 月齡的棕色和灰色小鼠各3只，取皮膚組織，用于提取總 RNA，同時(shí)收集鼠尾，用于提取基因組 DNA。

本試驗(yàn)所用的 PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time) kit 和 SYBR? PrimeScriptTMⅡ RT-PCR Kit 以及限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自大連寶生物公司，Site-Directed Gene Mutagenesis Kit 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco 公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine 2000 reagent 購(gòu)自 Invitrogen 公司，雙熒光測(cè)定試劑盒 Promega Dual Luciferase Assay Kit 購(gòu)自 Promega 公司。

1.2 總RNA提取和qRT-PCR

本試驗(yàn)中總 RNA 提取采用 TRIzol 法，設(shè)計(jì)并合成 miR-27a 和SCF的引物(表1)，分別以18S和U6為看家基因。反轉(zhuǎn)錄用 PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time) kit，熒光定量 PCR 用 SYBR? PrimeScriptTMⅡ RT-PCR Kit，每次試驗(yàn)進(jìn)行 4 次重復(fù)。

1.3 靶基因預(yù)測(cè)

在 PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/), TargetScan (http://www.targetscan.org/) and DIANA-microT (http://www.microrna.gr/microT) 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì) miR-27a 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 載體構(gòu)建

從 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索小鼠pri-miR-27a 序列(NR_029746.1)，在此基礎(chǔ)上，從 UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中搜索其上下游各延伸 100 bp 的序列，以此為參考，設(shè)計(jì)引物(表1)，并在上下游引物的5′端分別加上XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)堿基，以小鼠基因組 DNA(酚氯仿法提取)為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將產(chǎn)物克隆到 pUC-T 載體上，分別用XhoⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì) pUC-T 載體和 pMSCV PIG 載體進(jìn)行雙酶切，純化產(chǎn)物，T4 連接酶 16 ℃過(guò)夜連接，構(gòu)建重組載體 pMSCV-pri-miR-27a，經(jīng)轉(zhuǎn)化、LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)、液體培養(yǎng)基搖菌，質(zhì)粒提取(去內(nèi)毒素)，獲得大量重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定重組效果，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

從 NCBI 中搜索小鼠SCF3′UTR 序列(NM_013598.2)，設(shè)計(jì)引物(表1)擴(kuò)增包含 miR-27a 結(jié)合位點(diǎn)的片段，以小鼠 cDNA(TRIzol 法提取)為模板，上下游引物的5′端分別加上SacⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)堿基，將pUC-T 載體和 pmirGLO 載體進(jìn)行雙酶切、重組、測(cè)序，最后獲得 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 構(gòu)建突變載體

以 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 為模板，設(shè)計(jì)結(jié)合位點(diǎn)4個(gè)連續(xù)堿基突變的引物(表1)，用Site-Directed Gene Mutagenesis Kit 進(jìn)行突變，將突變過(guò)的載體轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序，最終保留突變成功的載體，即為 pmirGLO-SCF-mut-3′UTR。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEK 293 T 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)在添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染分3組進(jìn)行：pMSCV-pri-miR-27a + pmirGLO-SCF-wt-3′UTR，pMSCV-pri-miR-27a + pmirGLO-SCF-mut-3′UTR，pMSCV NC(空載體)+ pmirGLO-SCF-wt-3′UTR。轉(zhuǎn)染比例：24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔150 μg pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 或 pmirGLO-SCF-mut-3′UTR + 250 μg pMSCV-pri-miR-27a 或 pMSCV NC(空載體)。轉(zhuǎn)染 48 h后，收集細(xì)胞，用 Promega Dual Luciferase Assay Kit 處理，用 GLOMAXTM 96 Microplate Luminometer 測(cè)定熒光活性。

表1所有引物序列及用途

Table1Primersusedinthisstudy

引物名稱 引物序列(5′→3′) 用途SCFFGTCATTGTTGGCTACGAGARealtimePCRSCFRCACGAGGTCATCCACTATTTTRealtimePCRSCF3′UTRFCGAGCTCTGTTACCTTCGCACAGTGGCLuciferasereporter?wtSCF3′UTRRGCTCTAGAGCTCCACCGCATGGATAGAALuciferasereporter?wtSCF?3′UTR?mutFGGAGCAGAGTGCTTCGCACACAACCCTGCACTGAATTALuciferasereporter?mutSCF?3′UTR?mutRTAATTCAGTGCAGGGTTGTGTGCGAAGCACTCTGCTCCLuciferasereporter?mutmiR?27aFACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGRealtimePCRUniversalPrimerTGGTGTCGTGGAGTCGRealtimePCRU6FCTCGCTTCGGCAGCACARealtimePCRU6RAACGCTTCACGAATTTGCGTRealtimePCRmiR?27aRCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACTRealtimePCRMir?27aF?XhoⅠAAGCTCGAGCTGTCGCCAAGGATGTCTGTPCR?CloneMir?27aR?EcoRⅠGGAATTCAGGAGGCAGAGCAGGGTGPCR?Clone18S?FCTAAGGAGAAGGGCCAGTCCRealtimePCR18S?RCTCAAGTTGGGGGACAAAAARealtimePCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

熒光定量 PCR 數(shù)據(jù)采用 2-△△Ct計(jì)算法，熒光活性值 = 螢火蟲熒光值 / 海腎熒光值，最終數(shù)據(jù)分析均用 SPSS 軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 miR-27a 和 SCF 的表達(dá)量

根據(jù)熒光定量 PCR 的結(jié)果，miR-27a 在灰色小鼠皮膚中的表達(dá)量極顯著高于棕色小鼠(P<0.01)；而SCF在棕色小鼠皮膚中的表達(dá)量顯著高于灰色小鼠(P<0.05)(圖1)，這種相反的表達(dá)趨勢(shì)說(shuō)明 miR-27a 與SCF可能存在靶向關(guān)系，并且 miR-27a 可能抑制黑色素生成。

**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。圖1 miR-27a 和 SCF 分別在棕色和灰色小鼠皮膚中的表達(dá)量Fig.1 Expression of miR-27a and SCF mRNA in brown and gray mouse skin

2.2 載體重組及突變

經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，小鼠 pri-miR-27a 和SCF3′UTR 分別成功重組到 pMSCV PIG和pmirGLO載體上，插入片段分別為186 bp和658 bp，并且測(cè)序結(jié)果與 NCBI 上的參考序列完全一致，無(wú)突變、變異等，可用于后續(xù)研究。同時(shí)，載體成功突變，與野生型相比，存在 4 個(gè)連續(xù)堿基的突變，即位于SCFcDNA 1 202～1 205 bp 的 TGTG 突變?yōu)?ACAC，與引物設(shè)計(jì)時(shí)的突變堿基的位置和種類一致，可用于后續(xù)研究。

2.3 靶基因預(yù)測(cè)

通過(guò)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)，SCF是 miR-27a 的靶基因，并且結(jié)合位點(diǎn)位于SCFcDNA的1 200 ～1 207 bp，并且物種間序列保守(圖2)。

圖2 SCF 3′UTR上miR-27a的結(jié)合位點(diǎn)、突變位點(diǎn)及物種間的保守性Fig.2 The binding site and mutation site of miR-27a on the SCF 3′UTR and the conservatism across different species

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，HEK 293 T細(xì)胞生長(zhǎng)良好，轉(zhuǎn)染 48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，結(jié)果(圖3)顯示，綠色熒光蛋白表達(dá)良好，視野內(nèi)熒光密度及廣度都很好，說(shuō)明轉(zhuǎn)染效果良好，可用于測(cè)定雙熒光活性。

A為共轉(zhuǎn)染 miR-27a 過(guò)表達(dá)載體和SCF 3′UTR 雙熒光報(bào)告載體的 HEK 293 T 細(xì)胞(×100)白光照片； B為共轉(zhuǎn)染 miR-27a 過(guò)表達(dá)載體和SCF 3′UTR 雙熒光報(bào)告載體的 HEK 293 T 細(xì)胞(×100)熒光照片。圖3 轉(zhuǎn)染效率Fig.3 Transfection efficiency

2.5 雙熒光活性

2種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK 293 T細(xì)胞 48 h 后，收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞中的螢火蟲熒光和海腎熒光的活性值，其比值即為熒光活性，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn) pMSCV-pri-miR-27a和 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 的細(xì)胞中，熒光活性值為 7.38±0.43，而其他兩組分別為 13.18±2.06和 12.97±1.65，熒光活性下降約 44%，下降效果顯著(P<0.05)(圖4)。

a:pMSCV+SCF-3′UTR wt;b:pMSCV-miR-27a+SCF-3′UTR wt;c:pMSCV-miR-27a+SCF-3′UTR mut。*表示差異顯著(P<0.05)。圖4 3組轉(zhuǎn)染中的相對(duì)熒光值Fig.4 Relative luciferase value in three groups

3 討 論

miRNAs 是短片段 RNA，通常只有18～25 nt，不能編碼蛋白質(zhì)，通過(guò)與靶基因 mRNAs 3′UTR或 5′UTR 的不完全匹配抑制 mRNAs 翻譯成蛋白質(zhì)或通過(guò)降解 mRNAs 發(fā)揮抑制作用[1, 14-18]。隨著研究的深入，人們還發(fā)現(xiàn)一些 miRNAs 也可以與靶基因的 CDS 區(qū)結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用[19]。本研究中，miR-27a 就是與靶基因SCF的3′UTR 結(jié)合的，miRNAs 對(duì)靶基因有抑制作用，因此其在組織細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)可能是相反的，而本研究中 miR-27a 與SCFmRNA 在不同顏色小鼠的皮膚中的表達(dá)趨勢(shì)正是呈現(xiàn)這種相反的現(xiàn)象，這就為我們的假設(shè)提供基礎(chǔ)。

miRNAs 與其靶基因的靶向關(guān)系的確定主要通過(guò)2種方法，一種是生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，另一種是試驗(yàn)驗(yàn)證，二者結(jié)合，效果最佳。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)通常是基于種子序列的互補(bǔ)配對(duì)、保守性、自由能及結(jié)合位點(diǎn)的開(kāi)放性等[20]。試驗(yàn)驗(yàn)證也主要為雙熒光報(bào)告試驗(yàn)和過(guò)表達(dá)/敲除試驗(yàn)，前者從序列配對(duì)層面進(jìn)行驗(yàn)證，后者從生物學(xué)功能層面進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究利用3個(gè) miRNAs 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，因3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的算法略有差異[20]，保證了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示，SCF是 miR-27a 的靶基因，并且結(jié)合位點(diǎn)(種子序列)位于SCFmRNA 3′UTR，這符合 miRNAs 作用于靶基因的原理，同時(shí)為我們的假設(shè)提供了理論依據(jù)。

最后，通過(guò)構(gòu)建 miR-27a 的過(guò)表達(dá)載體及靶基因SCF3′UTR 的雙熒光報(bào)告載體，并將其共同轉(zhuǎn)染 HEK 293 T 細(xì)胞，測(cè)定熒光活性，從而確定miR-27a 與SCF之間的靶向關(guān)系。這一試驗(yàn)是從序列匹配方面對(duì) miRNAs 與靶基因的匹配關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，其原理是：當(dāng)過(guò)表達(dá)載體表達(dá)的 miRNAs 與雙熒光報(bào)告載體上的靶基因 3′UTR 序列配對(duì)并結(jié)合時(shí)，就阻斷雙熒光報(bào)告載體上螢火蟲熒光蛋白的表達(dá)，從而使熒光活性降低。

研究結(jié)果表明， miR-27a 參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過(guò)程。miR-27 促進(jìn)胎兒成骨細(xì)胞增殖，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管生成，抑制脂肪細(xì)胞的分化和脂肪形成，也促進(jìn)小鼠黑色素生成[2-7]。此外，miR-27a 還與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，如乳腺癌、胃癌和宮頸癌等[8-11]。研究結(jié)果表明 miR-27a-3p 與 Wnt3a 在不同毛色的小鼠皮膚中也表現(xiàn)出完全相反的表達(dá)趨勢(shì)[7]。除此之外，本課題組之前在羊駝上的研究結(jié)果也表明，miR-27a-3p 在白色羊駝皮膚中的表達(dá)量是棕色羊駝皮膚中的5.99倍[13]，因此，推測(cè) miR-27a 在黑色素生成過(guò)程中可能發(fā)揮抑制作用。

通過(guò)與 c-kit 結(jié)合，SCF可以間接影響黑色素細(xì)胞的遷移、增殖及存活等生物學(xué)過(guò)程[12]。當(dāng)哺乳動(dòng)物的皮膚黑色素細(xì)胞和成黑素細(xì)胞中有 c-kit 存在時(shí)，SCF介導(dǎo)黑色素細(xì)胞遷移、分化、生存、凋亡及黑色素生成等[21]。SCF有兩種亞型，即膜結(jié)合型和可溶型，在缺乏膜結(jié)合型 SCF 的小鼠中，成黑色素細(xì)胞可以被檢測(cè)到，但其不能遷移到皮膚組織，導(dǎo)致其毛色呈白色[22-23]。此外，表皮中 SCF 水平降低或者其對(duì) c-kit 的競(jìng)爭(zhēng)增強(qiáng)均會(huì)導(dǎo)致毛干不著色；相反，過(guò)表達(dá)膜結(jié)合型 SCF 會(huì)導(dǎo)致毛囊和表皮色素沉著過(guò)多[21]。

因此，我們推測(cè)，miR-27a 可能通過(guò)靶向SCF影響哺乳動(dòng)物皮膚中的黑色素細(xì)胞及黑色素生成。

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