李 菲，王 忠，卞文印，鐘李鳳

[安發(fā)(福建)生物科技有限公司， 福建 寧德 352100]

蛹蟲(chóng)草又名北冬蟲(chóng)夏草，屬于真菌門(mén)、子囊菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬[1]。蛹蟲(chóng)草含有豐富的生物活性成分，如蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖等，其中蟲(chóng)草素是一種核苷類(lèi)抗生素，能抑制 mRNA 合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 ，使細(xì)胞分化，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，尤其是對(duì)某些類(lèi)型的白血細(xì)胞抑制作用更為明顯[2-3]；蟲(chóng)草多糖可提高人體免疫功能，已臨床用于治療惡性腫瘤[3-4]。氮源作為蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)成分之一，對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)有著非常重要的作用。本試驗(yàn)系統(tǒng)研究氮源對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)及蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖含量的影響，以尋找適宜蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)及蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖積累的氮源，為生產(chǎn)富含蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖的蛹蟲(chóng)草提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蛹蟲(chóng)草菌種Cmα-001，由安發(fā)(福建)生物科技有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

葡萄糖、蔗糖、瓊脂、硫酸鎂、維生素B1、磷酸二氫鉀、蛋白胨、蠶蛹粉、牛肉膏、黃豆粉、酵母粉、硫酸銨、蟲(chóng)草素、甘露醇標(biāo)樣、甲醇(色譜純)、四氫呋喃(色譜純)、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚(分析純)等。

SW-CJ-1A超凈工作臺(tái)，SPX-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，TES1330A照度計(jì)，MS6508數(shù)顯溫濕度計(jì)，Waters高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測(cè)器，Part No.wato45905C18(4.6 mm×150 mm)色譜柱，漢邦C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，0.5 μm水相微孔濾膜，恒溫水浴鍋，722分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)處理

用于菌種分離培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、VB10.1 g，pH自然值；用于培養(yǎng)菌絲體的液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、MgSO41.0 g、KH2PO42.0 g、VB10.1 g，pH自然值，分裝至三角瓶；用于栽培的培養(yǎng)基：大米32 g、營(yíng)養(yǎng)液42 mL (蔗糖20 g、 MgSO41.0 g、KH2PO42.0 g、 VB10.1 g、水1000 mL，pH自然值)，以不加氮源作為對(duì)照(CK)，5個(gè)試驗(yàn)處理分別加入10 g·L-1的蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、蠶蛹粉、酵母粉作為氮源，分別編號(hào)為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，研究不同氮源對(duì)蛹蟲(chóng)草整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程、產(chǎn)量，以及對(duì)蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素含量的影響。

1.3 栽培方法

栽培種制備：將蛹蟲(chóng)草母種進(jìn)行分離，接種至斜面試管，放置于生化培養(yǎng)箱中18℃培養(yǎng)，從培養(yǎng)的第4 d開(kāi)始，每天進(jìn)行10 h光照培養(yǎng)，7 d左右獲得生產(chǎn)菌種。

液體種制備：在超凈工作臺(tái)下，將試管菌切成小碎塊，接種至液體培養(yǎng)基中，溫度20℃下靜置培養(yǎng)48 h，后置于搖床內(nèi)130 r·min-1下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，3 d左右獲得液體接種菌。將液體菌種稀釋5倍，即可用于接種大米培養(yǎng)基。

接種后搬進(jìn)培養(yǎng)室內(nèi)，溫度18～20℃下黑暗培養(yǎng)5 d左右，至菌絲吃透培養(yǎng)基；發(fā)菌完成后開(kāi)始進(jìn)行弱光照培養(yǎng)，在光照度200～400 lx、光照時(shí)長(zhǎng)10～12 h·d-1、溫度20℃、相對(duì)濕度70%～80%條件下培養(yǎng)4 d左右，至培養(yǎng)基完全轉(zhuǎn)為橙色；之后進(jìn)入原基分化階段，溫差控制在5～10℃，培養(yǎng)5 d左右，至有較多小刺尖狀突起形成；之后進(jìn)入子實(shí)體生長(zhǎng)階段，溫度22℃，相對(duì)濕度80%～90%，光照700～1 000 lx，每日光照10 h·d-1，培養(yǎng)35 d左右，采收時(shí)60℃烘干。

1.4 蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖含量的測(cè)定

高效液相色譜條件：C18柱，250 mm×4.6 mm(i.d.)，5 μm，流動(dòng)性：乙腈∶水為5∶95，用前過(guò)0.45 μm濾膜，脫氣。流速：1.0 mL·min-1，柱溫：35℃，波長(zhǎng)：260 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定：準(zhǔn)確吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，用水定容、搖勻，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度設(shè)為1.00、2.00、5.00、10.0、20.0和50.0 μg·mL-1，按色譜條件測(cè)定，以蟲(chóng)草素質(zhì)量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求線(xiàn)性回歸方程。

提取蟲(chóng)草多糖：取每組樣品粉末，以無(wú)水乙醇提取10 h除去脂溶性成分，自然風(fēng)干，取脫脂后的殘?jiān)?0℃恒溫提取2次，過(guò)濾，取濾液減壓濃縮，濃縮液以Savag法除去蛋白質(zhì)，最后移入100 mL的容量瓶中，冷卻定容備用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：精確稱(chēng)取葡萄糖200 mg置于100 mL容量瓶中，定容搖勻，取1 mL溶液溶于50 mL容量瓶中定容搖勻，備用。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,用蒸餾水補(bǔ)充至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1 mL，靜止10 min,搖勻靜置20 min，于490 nm處測(cè)定吸光值，以2.0 mL蒸餾水作為空白，獲得回歸方程：A=0.0089C+0.0117，r=0.9950。其中，A為吸光值，C為葡萄糖濃度。

精確吸取樣品處理液1.0 mL置于10 mL比色管中，加水補(bǔ)足至2.0 mL，樣品管和空白管中加入苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加濃硫酸5.0 mL，搖勻放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，以空白校正零點(diǎn)，于490 nm處用1.0 mL比色皿測(cè)吸光度[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種氮源對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)菌的影響

由表1可知，添加蛋白胨、蠶蛹粉的菌絲健壯、濃密、潔白，菌絲生長(zhǎng)速度較快，且菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于添加牛肉膏、黃豆粉、酵母粉處理。對(duì)照處理蛹蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)速度顯著低于各添加氮源處理。說(shuō)明適當(dāng)添加氮源有利于蛹蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)。

表1 不同氮源對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)菌階段的影響

注：表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示其在0.05水平下差異顯著，下表同。

2.2 5種氮源對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)的影響

由表2可知，添加氮源處理蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的畸形率顯著低于對(duì)照；添加氮源處理蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的平均高度顯著高于對(duì)照。除處理Ⅵ外，各處理的出草率均顯著高于對(duì)照。說(shuō)明添加氮源有利于子實(shí)體生長(zhǎng)，且以添加蠶蛹粉處理最佳，其次是添加蛋白胨處理。除處理Ⅵ外，各處理的干品產(chǎn)量均顯著高于對(duì)照，且添加蠶蛹粉處理干品產(chǎn)量最高。

表2 5種氮源對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)的影響

2.3 5種氮源對(duì)蟲(chóng)草素及蟲(chóng)草多糖含量的影響

由表3可知，與對(duì)照處理相比，添加氮源處理蟲(chóng)草素的含量及產(chǎn)量、蟲(chóng)草多糖的含量與產(chǎn)量均增加，說(shuō)明添加氮源更有利于蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖的積累。添加蠶蛹粉處理的蟲(chóng)草素含量及產(chǎn)量均明顯高于其他處理，蛋白胨次之。添加蛋白胨處理的蟲(chóng)草多糖含量顯著高于其他氮源處理，添加蠶蛹粉處理的蟲(chóng)草多糖產(chǎn)量顯著高于其他處理。

表3 5種氮源對(duì)蟲(chóng)草素及蟲(chóng)草多糖含量的影響

3 討論

添加氮源對(duì)蛹蟲(chóng)草整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程都有很大的促進(jìn)作用，且以添加蛋白胨和蠶蛹粉處理更有利于蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)，子實(shí)體產(chǎn)量和質(zhì)量均較高，蟲(chóng)草素的含量與產(chǎn)量，蟲(chóng)草多糖的含量及產(chǎn)量均相對(duì)較高。說(shuō)明添加蛋白胨和蠶蛹粉均能促進(jìn)蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)及有效成分的積累。添加蠶蛹粉處理的蟲(chóng)草素含量及產(chǎn)量均最高，分別達(dá)到(7.93±0.092)mg·g-1和每瓶(34.06±0.158)mg。添加蛋白胨處理蟲(chóng)草多糖含量最高，達(dá)到(21.36±0.076)mg·g-1，但由于子實(shí)體產(chǎn)量相對(duì)添加蠶蛹粉處理低，造成蟲(chóng)草多糖產(chǎn)量低于添加蠶蛹粉處理；添加蠶蛹粉處理的蟲(chóng)草多糖產(chǎn)量最高，每瓶達(dá)(103.85±0.169)mg。因此，建議添加蠶蛹粉作為氮源，更適合高產(chǎn)量、高質(zhì)量蛹蟲(chóng)草的栽培生產(chǎn)。

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