胡桂羽, 王曼曼, 念琪循, 李 娜, 董鑫鑫, 郝玉蘭, 王 茜, 王學(xué)生(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 河北 唐山 063000)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)的碳氫化合物,是一類持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)。PAHs具有“三致”毒性(致畸、致癌、致突變),歐盟、美國、中國等都將其列為環(huán)境優(yōu)先控制污染物。因此,準確評價PAHs的人體暴露水平,對于環(huán)境健康風(fēng)險評價及毒理學(xué)研究具有重要意義[1,2]。

PAHs通常分布在空氣、水體、土壤、食物、煙草煙霧等介質(zhì)中,可經(jīng)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚接觸等途徑進入人體,經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化為羥基多環(huán)芳烴(OH-PAHs),并以葡萄糖醛酸鹽和磺酸鹽的形式由尿液排出[3-7]。因此,國內(nèi)外常以尿液中的OH-PAHs作為生物標志物來綜合評價PAHs的人體暴露水平[8]。常見的OH-PAHs有2-羥基芴(2-FLU)、1-羥基菲(1-OHPe)、3-羥基菲(3-OHPe)和1-羥基芘(1-OHP),其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖 1 4種OH-PAHs的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of the four hydroxyl polycyclic aromatic hydrocarbons (OH-PAHs)

目前主要采用色譜法分析尿液中的OH-PAHs[1,8-11],但是尿液中待測組分的含量較低,難以檢出,且尿液成分復(fù)雜,雜質(zhì)干擾嚴重,因此在儀器分析前需對樣品中的待測物進行富集和凈化。尿液中OH-PAHs的前處理方法有液液萃取法(LLE)[12-14]和固相萃取法(SPE)[8]。液液萃取法需要消耗大量的有機溶劑且萃取效率有限;固相萃取法因具有萃取效率高、有機溶劑消耗少的特點而被廣泛應(yīng)用,但是目前商品化C18萃取柱往往是一次性的,使用成本較高。

吸附劑是固相萃取技術(shù)的核心,不僅決定了方法的準確度,還影響方法的分析時間和成本。聚合物整體柱作為一種應(yīng)用廣泛的吸附分離材料,通常是通過反應(yīng)試劑原位聚合而得到的棒狀整體,由于具有結(jié)構(gòu)多孔、比表面積大、生物兼容性好等優(yōu)點,已成功用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品衛(wèi)生等領(lǐng)域的樣品前處理中[15-17]。本課題組建立了以甲基丙烯酸丁酯為單體的在線凈化柱,結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜法,分析測定了食品中阿維菌素殘留[18]。

本實驗在注射器空管中構(gòu)筑甲基丙烯酸丁酯吸附劑,得到的固相萃取柱用于凈化富集尿液中的OH-PAHs,結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD),建立了一種簡單、經(jīng)濟的測定尿液中4種OH-PAHs的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200型高效液相色譜-熒光檢測器(美國Agilent公司); HSC-12A氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司); Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

甲基丙烯酸丁酯(butyl methacrylate, BMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate, EDMA)購自上海阿拉丁試劑公司;正丙醇、聚乙二醇、偶氮二異丁腈購自天津市光復(fù)精細化工研究所;β-葡萄糖醛酸酶水溶液(Type HP-2)、甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)(色譜純)均購自美國Sigma-Aldrich公司。丙酮、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、乙酸鈉和醋酸均為國產(chǎn)分析純。

2-FLU(純度98.0%)購自上海阿拉丁試劑公司;1-OHPe(純度98.0%)、3-OHPe(純度98.0%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;1-OHP(純度98.0%)購自美國Sigma-Aldrich公司。

用MeOH配制待測物的標準儲備液,質(zhì)量濃度為2 μg/mL,于4 ℃避光保存;用水稀釋上述標準儲備液,配制成質(zhì)量濃度為25 ng/mL的標準工作液,于4 ℃避光保存,待用。

1.2 整體柱的制備

參照課題組報道的方法在固相萃取模具中合成聚合物整體柱[18]。準確量取單體BMA 160 μL、交聯(lián)劑EDMA 565 μL、丙醇1 000 μL和聚乙二醇875 μL(均為致孔劑),加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈10 mg,于室溫下超聲混合、脫氣,取500 μL上述混合液灌入2 mL注射器空柱管中,將兩端密封后于60 ℃水浴反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后用甲醇沖洗未反應(yīng)的單體及致孔劑,得到聚(甲基丙烯酸丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(poly(BMA-co-EDMA))固相萃取柱。

1.3 尿液樣品的制備

收集:在8 h工作制下,對連續(xù)工作3天的河北省某地焦爐工人收集晨尿,于-20 ℃冷凍保存。

將尿液樣品解凍,混勻,取5.0 mL置于離心管中,加入10 μLβ-葡萄糖醛酸酶、5.0 mL醋酸鈉緩沖溶液(pH 5),于37 ℃避光水解過夜。將水解后的尿液樣品以1 500 r/min離心10 min,取上清液于4 ℃儲存待用。

1.4 固相萃取

依次用2 mL ACN和水平衡poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱,然后將3 mL酶解后的尿液樣品上樣至萃取柱,用3 mL 25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液進行淋洗,最后以2 mL ACN為洗脫液進行洗脫,收集洗脫液,于37 ℃氮吹至干,用甲醇定容至0.25 mL。

1.5 分析條件

色譜柱為Supelcosil LC-PAH柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Supelco公司);流動相為(A)水和(B)ACN;流速為1 mL/min。梯度洗脫程序:0～6.5 min, 50%B; 6.5～9.0 min, 50%B～55%B; 9.0～20.0 min, 55%B。進樣體積為20 μL。

4種OH-PAHs的激發(fā)波長(λx)和發(fā)射波長(λm): 2-Flu, 266 nm/366 nm; 3-OHPe, 250 nm/358 nm; 1-OHPe, 284 nm/383 nm; 1-OHP, 242 nm/396 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化

通常尿液中OH-PAHs的前處理主要采用C18固相萃取柱,但由于OH-PAHs是一類非極性化合物,本實驗采用的poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱,其聚合物骨架表面的丁基具有疏水性,可用于固相萃取尿液中的OH-PAHs。為了獲得最佳的萃取效率,實驗考察了上樣濃度、淋洗液、洗脫液和洗脫體積對萃取效率的影響。

2.1.1上樣濃度

實驗考察了上樣濃度對萃取效率的影響(見圖2a)。分別以2、10、20和40 ng/mL的加標尿樣為考察對象,按照1.4節(jié)操作進行前處理。結(jié)果表明,當(dāng)質(zhì)量濃度為2～40 ng/mL時,4種OH-PAHs的萃取效率為71.0%～103.9%,隨著OH-PAHs質(zhì)量濃度的增加(10～40 ng/mL),萃取效率無顯著變化。說明固相萃取柱對OH-PAHs具有令人滿意的吸附能力,且表現(xiàn)出良好的萃取容量。

圖 2 (a)上樣濃度、(b)淋洗液、(c)洗脫液和(d)洗脫體積對4種OH-PAHs萃取效率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of (a) loading concentration, (b) washing solvent, (c) eluent and elution volume (d) on the recoveries of the four OH-PAHs (n=3)

2.1.2淋洗液

上樣后目標化合物和部分雜質(zhì)同時保留在固相萃取柱上,而必要的洗滌步驟可以將干擾化合物去除,使分析物仍保留在萃取柱上,因此淋洗液的選擇至關(guān)重要。對3 mL 25 ng/mL的加標尿液樣品進行分析,固定淋洗液體積為3.0 mL,分別使用MeOH-水(20∶80, v/v)、25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L磷酸二氫鈉進行淋洗,2 mL ACN洗脫。如圖2b所示,當(dāng)采用25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液為淋洗液時,4種OH-PAHs的整體回收率最高,故選為實驗所用。

2.1.3洗脫液和洗脫體積

洗脫液也是影響萃取效率的重要參數(shù)?？紤]到分析物的溶解度,考察了MeOH、ACN、丙酮和乙酸乙酯作為洗脫液時4種OH-PAHs的回收率。對3 mL 25 ng/mL的加標尿樣進行分析,用3 mL 25 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液淋洗,固定洗脫液體積為2 mL,分別使用上述4種不同洗脫液進行洗脫。結(jié)果如圖2c所示,ACN的洗脫效果最佳,選為實驗所用。

實驗同時考察了洗脫體積(1、2和3 mL)對萃取效果的影響(見圖2d)。結(jié)果表明,洗脫體積從1 mL增加到2 mL時,洗脫效率增加;繼續(xù)增加洗脫體積,洗脫效率無明顯變化,但是大量的洗脫液容易在氮吹、濃縮步驟中導(dǎo)致分析物的損失和時間的增長。因此最終選擇2 mL ACN進行洗脫。

在最優(yōu)條件下,結(jié)合HPLC-FLD,分別對0.3 ng/mL的加標尿液樣品進行直接進樣和固相萃取。結(jié)果表明,與OH-PAHs標準溶液的色譜圖(見圖3a)相比,直接進樣時未檢出OH-PAHs,且雜質(zhì)峰明顯(見圖3b);經(jīng)固相萃取后,OH-PAHs得到富集,可以看到明顯的色譜峰,且雜質(zhì)峰明顯降低(見圖3c),說明該方法能夠有效去除尿液中的雜質(zhì),富集OH-PAHs。當(dāng)上樣體積為3 mL時,固相萃取柱對OH-PAHs的富集倍數(shù)為6。

圖 3 (a)標準溶液和(b)直接進樣、(c)經(jīng)固相萃取后的加標尿液樣品中4種OH-PAHs(0.3 ng/mL)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the four OH-PAHs (0.3 ng/mL) in (a) a standard solution and spiked urine samples by (b) direct sampling and (c) SPE

2.2 標準曲線、檢出限和精密度

對質(zhì)量濃度為1.2～200.0 ng/mL的OH-PAHs標準溶液進行分析,對OH-PAHs的峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x, ng/mL)進行線性回歸,建立標準曲線。結(jié)果表明,4種OH-PAHs均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 1～0.999 7(見表1)。

在空白尿液中添加不同質(zhì)量濃度的待測物,計算方法的檢出限(LODs,S/N=3)和定量限(LOQs,S/N=10),分別為0.06～0.09 ng/mL和0.20～0.30 ng/mL(見表1)。 對同一尿液樣品進行分析,以日內(nèi)(n=5)和日間(n=3)重復(fù)測定得到的色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)計算精密度,日內(nèi)RSD和日間RSD分別為1.4%～5.3%和2.6%～7.3%。結(jié)果表明本方法具有良好的靈敏度和重現(xiàn)性。

表14種OH-PAHs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和精密度

Table1Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), LODs, LOQs and precisions of the four OH-PAHs

OH?PAHLinearrange/(ng/mL)RegressionequationrLOD/(ng/mL)LOQ/(ng/mL)RSDs/%Intra?day(n=5)Inter?day(n=3)2?Flu1．2-200y=7314．8x+0．02080．99970．090．303．15．63?OHPe1．2-200y=5301．1x+0．55790．99970．080．255．36．21?OHPe1．2-200y=6321．6x+3．93180．99940．060．204．77．31?OHP2．4-200y=4097．4x-10．1050．99910．060．201．42．6

y: peak area;x: mass concentration, ng/mL.

2.3 穩(wěn)定性

采用同一批次(n=5)和不同批次(n=4)合成的固相萃取柱對加標尿液樣品進行固相萃取。結(jié)果顯示,使用同一批次和不同批次制備的固相萃取柱對4種OH-PAHs進行萃取，得到的色譜圖無明顯差異,峰形良好且響應(yīng)值穩(wěn)定,色譜峰面積的RSD分別為2.3%～5.6%和2.9%～7.9%。同時,使用3根萃取柱分別進行10次重復(fù)萃取,發(fā)現(xiàn)萃取效率沒有明顯下降(RSD≤3.6%)。

表 2 焦爐工人尿液樣品中4種OH-PAHs的含量Table 2 Contents of the four OH-PAHs in urine samples of coke oven workers

N.D.: not detected.

2.4 實際樣品分析

在最優(yōu)實驗條件下,對4名焦爐工人的尿液樣品進行分析,結(jié)果見表2。在4個樣品中均有2-Flu、3-OHPe和1-OHP的檢出,質(zhì)量濃度為1.0～9.5 ng/mL。

為進一步說明方法的可行性,對4份實際樣品進行加標回收試驗,加標水平為3 ng/mL,加標回收率為78.2%～117.0%,方法準確度令人滿意。

2.5 與文獻方法對比

將實驗結(jié)果與文獻方法進行對比(見表3),與液液萃取法或基于商品化的C18固相萃取法相比,本方法靈敏、準確。

表 3 本方法與文獻方法的對比Table 3 Comparison of the present method with previously reported methods

LLE: liquid-liquid extraction; poly(BMA-co-EDMA): poly(butyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) monolithic column.

3 結(jié)論

本研究采用基于poly(BMA-co-EDMA)整體柱的固相萃取法,結(jié)合HPLC-FLD分析了尿液中4種OH-PAHs。該方法的靈敏度和精密度良好,同時萃取柱具有良好的穩(wěn)定性,相比于傳統(tǒng)的商品化固相萃取柱,該柱能夠反復(fù)使用,節(jié)約成本。該方法可用于復(fù)雜樣品中非極性物質(zhì)的分析。

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