徐 誠(chéng), 張圣虎, 張 毅, 浦躍樸, 尹立紅, 張 娟, 宋寧慧*(. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 教育部環(huán)境醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 0000; . 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所, 江蘇 南京 004)

圖 1 螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of spirotetramat and its metabolites

螺蟲乙酯(spirotetramat, S)是德國(guó)Bayer公司開發(fā)的一種新型特窗酸類殺蟲劑,屬于季酮酸類化合物,化學(xué)名稱為4-(乙氧基羰基氧基)-8-甲氧基-3-(2,5-二甲苯基)-1-氮雜螺[4,5]-癸-3-烯-2-酮,分子式為C21H27NO5。螺蟲乙酯作為殺蟲劑的作用機(jī)理是通過干擾昆蟲的脂肪生物合成導(dǎo)致幼蟲死亡和降低成蟲的繁殖能力[1],以達(dá)到防治多種蚜蟲、介殼蟲等刺吸式口器害蟲和害螨的效果,目前已廣泛應(yīng)用于柑橘的防蟲害中。螺蟲乙酯具有中到低毒,對(duì)動(dòng)物和人的皮膚具有潛在致敏性,對(duì)眼睛有刺激作用[2,3]。螺蟲乙酯在動(dòng)植物體內(nèi)的降解產(chǎn)物主要有4種,分別是BYI08330-烯醇糖苷(BYI08330-enol-glucoside, B1)、BYI08330-醇酮(BYI08330-ketohydroxy,B2)、BYI08330-烯醇(BYI08330-enol, B3)和BYI08330-羥基(BYI08330-mono-hydroxy, B4),結(jié)構(gòu)式見圖1。雖然螺蟲乙酯屬于低毒殺蟲劑,但其具有很好的雙向內(nèi)吸傳導(dǎo)性,可通過植物的木質(zhì)部和韌皮部向頂(上)傳導(dǎo),也可在植株內(nèi)由上向下傳導(dǎo),殺蟲譜廣,在環(huán)境中難揮發(fā)、難降解,持效期較長(zhǎng)[4]。為了保證柑橘的品質(zhì)和食用安全,對(duì)螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物進(jìn)行環(huán)境安全評(píng)價(jià),建立高效準(zhǔn)確地檢測(cè)柑橘中螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物殘留量的分析方法具有重要意義。

目前,國(guó)內(nèi)外螺蟲乙酯的測(cè)定方法主要有液相色譜法(LC)[5-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-13]等,螺蟲乙酯代謝產(chǎn)物的分析方法主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14,15]。LC選擇性差,靈敏度低,樣品檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng);LC-MS/MS具有較高的選擇性,但在MS/MS模式下檢測(cè)樣品時(shí)依然存在高背景值或潛在的基質(zhì)干擾,尤其是在復(fù)雜基質(zhì)中和低濃度水平下檢測(cè)[16]。目前,已有研究[17-19]表明，使用MS3技術(shù)成功分析了植物中化合物的殘留,但是使用超高效液相色譜-三重四極桿-離子阱質(zhì)譜(UPLC-Q TRAP MS)技術(shù)定量檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物殘留的研究尚未見報(bào)道。

本文在QuEChERS前處理方法的基礎(chǔ)上,建立了超高效液相色譜-三重四極桿-離子阱質(zhì)譜檢測(cè)柑橘中螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物殘留量的方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏、分離效果好,準(zhǔn)確度與精密度均能達(dá)到定量分析的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Triple Quad 4500超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(AB Sciex公司,美國(guó)); Ultra-Turrax?T18 Basic均質(zhì)儀(IKA公司,德國(guó)); 5804高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó))。

S(純度99.2%)、B1(C24H33NO8,純度98.6%)、B2(C18H23NO4,純度92.8%)、B3(C18H23NO3,純度99.6%)和B4(C18H25NO3,純度98.2%)均購(gòu)自德國(guó)Bayer公司。乙腈和甲酸均為色譜純(Tedia公司,美國(guó));氯化鈉(于140 ℃烘烤4 h)、無水硫酸鈉(于130 ℃烘烤4 h)(Sigma-Aldrich公司,美國(guó))、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)(Agilent公司,美國(guó))。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品,置于50 mL容量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冷藏保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別用乙腈逐級(jí)稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制質(zhì)量濃度為5、10、50、100、200、500和1 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液:空白基質(zhì)按照樣品前處理方法進(jìn)行處理，得到基質(zhì)空白樣品,然后添加螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品,并用乙腈進(jìn)行稀釋,得到系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確量取柑橘全果樣品20 g,置于80 mL離心管中,依次加入20 mL乙腈、4 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉,混勻,用均質(zhì)器在15 000 r/min的條件下均質(zhì)提取2 min,然后以8 000 r/min離心5 min,取上清液于10 mL離心管中,加入0.10 g PSA、10 mg GCB和0.30 g無水硫酸鎂凈化,渦旋3 min,然后以8 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm濾膜,用乙腈-0.01%(v/v)甲酸水溶液(1∶1, v/v)定容至1 mL,待UPLC-Q TRAP MS測(cè)定。

將柑橘去皮,果肉和果皮分別粉碎,其余前處理方法同柑橘全果。

1.4 分析條件

色譜柱:Agilent EC-C18 (75 mm×2.7 mm, 2.7 μm);流動(dòng)相:A為0.01%(v/v)甲酸水溶液，B為乙腈;流速:0.30 mL/min。梯度洗脫程序:0.5～1.0 min, 95%A～55%A; 1.0～4.0 min, 55%A; 4.0～4.8 min, 55%A～5%A; 4.8～6.0 min; 5%A; 6.0～6.1 min, 5%A～95%A; 6.1～7.1 min; 95%A。進(jìn)樣體積:5 μL。

離子源:ESI源,正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源溫度(TEM): 540 ℃;離子源噴霧電壓:4.8 kV;窗簾氣(CUR)壓力:204 kPa;霧化氣(Gas 1)壓力:340 kPa;輔助加熱氣(Gas 1)壓力:374 kPa;碰撞氣(CAD)壓力:34 kPa。螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)和其他參數(shù)見表1。

表 1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the target compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了在4種不同流動(dòng)相(甲醇-0.01%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-水、乙腈-0.01%(v/v)甲酸水溶液和乙腈-水)條件下目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明,流動(dòng)相為乙腈-0.01%(v/v)甲酸水溶液時(shí),螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的離子對(duì)響應(yīng)強(qiáng)度最高,因此選為實(shí)驗(yàn)所用。螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/L)在此流動(dòng)相條件下的MRM色譜圖見圖2。

圖 2 空白樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/L)中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of spirotetramat and its metabolites in a blank sample and a standard solution (200 μg/L)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物MS3躍遷離子的選擇以及去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化。取200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用針泵進(jìn)樣的方式進(jìn)樣,首先進(jìn)行母離子掃描(Q1 Scan),獲取S、B1、B2、B3和B4的母離子,其m/z分別為374.1、318.1、464.1、302.1、和304.1,在MRM掃描模式下優(yōu)化DP、CE等質(zhì)譜參數(shù),然后得到待測(cè)物第二極前體離子,其m/z分別為302.3、300.2、253.1、253.1和254.1。在線性離子阱(LIT)捕集的MS3光譜中顯示出強(qiáng)烈的第三極離子,其m/z分別為270.3、268.2、225.1、225.2和148.2。優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本方法采用QuEChERS對(duì)樣品進(jìn)行前處理,該方法主要通過將含多種官能團(tuán)的吸附材料復(fù)合以吸附生物樣品中的主要干擾雜質(zhì),同時(shí)將水溶性的被測(cè)物質(zhì)留在樣品溶液中,從而達(dá)到富集的目的。選取PSA作為凈化材料,其有效成分為PSA表面鍵合的氨基,可有效去除樣品中的金屬離子、糖類、脂肪酸、葉黃素、甾醇、親脂性色素等極性物質(zhì),但對(duì)水溶性色素的凈化能力不理想。因此本研究在PSA的基礎(chǔ)上添加了GCB。GCB對(duì)色素、類胡蘿卜、固醇和平面結(jié)構(gòu)的基質(zhì)干擾物有較強(qiáng)的吸附凈化能力,但是由于其表面的六元環(huán)結(jié)構(gòu)會(huì)吸附一些平面及對(duì)稱結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,導(dǎo)致回收率降低,因而還對(duì)凈化過程中GCB的用量(5、10、15和20 mg)進(jìn)行了優(yōu)化(見圖3)。結(jié)果表明,當(dāng)GCB的用量為10 mg時(shí),柑橘中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的回收率均較好,故選為實(shí)驗(yàn)所用。

圖 3 GCB的用量對(duì)柑橘中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物回收率的影響Fig. 3 Effect of amount of graphitized carbon black (GCB) on the recoveries of spirotetramat and its metabolites in citrus

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部組織制定的《農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》[20]進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。按照1.2節(jié)方法配制質(zhì)量濃度為2～1 000 μg/L的系列柑橘(全果、果肉和果皮)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液,以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)。柑橘基質(zhì)中螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)>0.99;采用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法,以信噪比(S/N)為3和10時(shí)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物的檢出限和定量限分別為0.08～0.49 μg/kg和0.26～1.62 μg/kg(見表2)。與其他采用MS2技術(shù)報(bào)道[11,13]的LOD(0.12～1.40 μg/kg)和LOQ(0.40～4.90 μg/kg)值相比,本方法的檢出限和定量限較低,說明方法的靈敏度較高。

表 2 柑橘全果、果肉和果皮樣品中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of spirotetramat and its metabolites in flesh, peel, whole fruit of citrus

y: peak area;x: mass concentration, μg/L

圖 4 柑橘果皮、果肉和全果樣品中目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 4 Matrix effects of the target compounds in peel, flesh and whole fruit of citrus

2.5 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

采用串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)樣品時(shí)往往會(huì)存在基質(zhì)效應(yīng)的干擾,基質(zhì)效應(yīng)主要受樣品基質(zhì)、化合物性質(zhì)和離子源監(jiān)測(cè)模式等因素的影響。為了評(píng)估本次研究產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的大小,同時(shí)建立螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物的溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)(柑橘全果、果肉、果皮)標(biāo)準(zhǔn)曲線,以相同濃度下二者峰面積之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),公式為ME=(A乙腈-A基質(zhì))/A乙腈×100%,其中A乙腈和A基質(zhì)分別表示采用乙腈和基質(zhì)溶液為溶劑時(shí)目標(biāo)化合物的峰面積。ME值的可接受范圍為-10%～10%。本研究同時(shí)對(duì)比了在MS2和MS3條件下螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的基質(zhì)效應(yīng)(見圖4)。結(jié)果表明，使用MS3檢測(cè)時(shí),相較于MS2,螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物在3種基質(zhì)(柑橘全果、果肉、果皮)中的基質(zhì)效應(yīng)分別降低了55.55%、64.77%和58.97%。因此使用MS3檢測(cè)存在較高基質(zhì)背景值的復(fù)雜樣品可在一定程度上減小基質(zhì)效應(yīng)引起的偏差。

表 3 螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)誤差(n=8)Table 3 Recoveries, RSDs and relative errors (REs) of the spirotetramat and its four metabolites (n=8)

RE: (measured value/actual value-1)×100%.

2.6 回收率和精密度

按照1.3節(jié)對(duì)空白樣品進(jìn)行前處理,分別添加5、100和500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。柑橘中螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物的加標(biāo)回收率為94.0%～98.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～5.3%,相對(duì)誤差(RE)為-1.3%～-6.0%(見表3)。

2.7 田間試驗(yàn)

2013年6月10日～2014年12月30日選擇我國(guó)柑橘種植代表性地區(qū)江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn)溫州蜜柑作為實(shí)驗(yàn)作物,采用建立的UPLC-Q TRAP MS方法對(duì)螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物殘留進(jìn)行檢測(cè)。在距最后一次施藥間隔時(shí)間為20、30、40 d時(shí)對(duì)柑橘進(jìn)行采樣,每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次,在施藥含量最高推薦量(60 mg/kg)用藥時(shí),柑橘果肉、果皮、全果樣品中螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物的殘留總量分別為5.93～14.20、11.30～17.86和1.30～16.51 μg/kg(見表4),殘留量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)最大殘留限量值1.00 mg/kg[21]。

表 4 柑橘果肉、果皮、全果中螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物的殘留量Table 4 Residues of the spirotetramat and its four metabolites in flesh, peel, whole fruit of citrus

3 結(jié)論

本文基于QuEChERS的前處理方法,建立了超高效液相色譜-三重四極桿-離子阱質(zhì)譜檢測(cè)柑橘中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物殘留的方法。該方法操作簡(jiǎn)便,快速準(zhǔn)確,靈敏度高,分離效果好,準(zhǔn)確度與精密度均能達(dá)到定量分析的要求,適用于柑橘中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物殘留的定性定量檢測(cè)。

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