成大欣, 徐麗然, 于清清, 高守翠, 王曉靖, 劉 懿, 劉恩岐, 趙四海

(1. 陜西省人民醫(yī)院新生兒科, 西安 710068; 2. 西安交通大學醫(yī)學部動物中心, 西安 710061)

規(guī)律成簇的間隔短回文重復及其相關(guān)蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated protein 9, CRISPR/Cas9)基因編輯技術(shù)是目前最熱門的基因編輯技術(shù)，科學家們可利用引導核糖核酸(guide ribonucleic acid,gRNA)引導Cas9核酸酶在多種細胞的特定基因組位點上進行切割、修飾[1-3]。很長時間以來, 胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES細胞)只有在小鼠中比較成功地進行了體外培養(yǎng)建系, 在其他動物, 比如家兔等, 雖然取得一定進展, 但離實際應用仍有距離[4]。在基于ES細胞的基因敲除技術(shù)應用上, 由于除小鼠外的動物缺乏ES細胞, 故難在實現(xiàn)在體的基因敲除[4-6]。由于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效性(成功率可達90%以上), 可以直接在胚胎上進行操作, 不用借助ES細胞, 這就突破了基于ES細胞同源重組技術(shù)的種屬限制[1,7-9]。CRISPR/Cas9技術(shù)使得在不同物種進行基因編輯成為可能，基因修飾技術(shù)實施起來變得更便利，基因修飾動物的應用得到進一步擴大[1-3]。除小鼠外的基因修飾動物模型, 如家兔[7-11]、大鼠[12,13]、豬[14]和靈長類[15]基因修飾動物模型, 也快速發(fā)展起來。CRISPR/Cas9技術(shù)的實施需要研究者自行設計gRNA, 引導Cas9核酸酶進行切割。如何篩選gRNA,在體外驗證其結(jié)合靶序列引導Cas9核酸酶進行切割的能力, 往往在實驗前(如受精卵注射)需要進行篩選。現(xiàn)有利用體外培養(yǎng)細胞驗證gRNA效率的方法相對較復雜, 花費較大。本實驗以家兔扭轉(zhuǎn)蛋白2A(torsin family 2 member A,TOR2A)基因的gRNA設計和篩選為例, 介紹一種簡單的gRNA體外篩選方法(圖1)。相比傳統(tǒng)的gRNA制備方法, 該方法簡單易行, 不用將打靶序列克隆進質(zhì)粒[16]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

圖 1 gRNA打靶效率的篩選Figure 1 In vitro target efficiency screening of gRNAs

pX330 (編號71707) 質(zhì)粒由密歇根大學張繼峰博士惠贈; 瓊脂糖(西班牙Biowest公司); Tris和EDTA(美國Genview公司); 基因組DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司); T7-ScribeTMStandard RNA IVT Kit(美國 CELLSCRIPT公司); miRNeasy Mini Kit(美國QIAGEN公司); Cas9內(nèi)切酶(美國NEB公司); PCR mix(中國擎科新業(yè)生物公司); PCR儀(德國Eppendorf公司); 電泳儀(中國北京六一生物科技有限公司); NanoDrop超微量紫外-可見光分光光度計(美國Thermo公司); 凝膠成像系統(tǒng)(中國上海培清科技有限公司); 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 gRNA的在線設計

以家兔TOR2A(TOR2A ENSOCUG00000006907)為例，根據(jù)分析，將2號外顯子序列用在線軟件設計打靶用gRNA，可選用如http://crispr.mit.edu/或http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx等在線工具。

1.3 gRNA的擴增與純化

以pX330質(zhì)粒為模板，正向引物為(用以上選定gRNA序列替換引物中N): TGTAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-gttttagagctagaaatagc; 反向引物: AGCACCGACTCGGTGCCACT。PCR程序為: 98 ℃預變性 2 min, 94℃變性10 s, 68 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，切割目的片段的凝膠，按膠回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物。分別以回收產(chǎn)物為模板，按照T7-ScribeTMStandard RNA IVT Kit說明書, 選用20 μL體系, 將3個含gRNA序列的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用miRNeasy Mini Kit純化gRNA,純化后的gRNA用NanoDrop定量，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 含打靶序列的PCR擴增與膠回收

抽取普通級家兔(西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，SCXK(陜)2012-003)血液200 μL，按基因組提取試劑盒說明，提取基因組DNA用做模板。一般PCR目的片段可設計在300～1 000 bp。在TOR2A目的基因擴增中, 正向引物: GCCGTCTGGAAGGCTCT; 反向引物: GGAGTGACTGTCACCAGCC，產(chǎn)物為386 bp。98 ℃預變性 2 min，94 ℃變性 10 s，67 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，切割目的片段凝膠，按膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物。

1.5 體外gRNA引導的Cas9酶切效率鑒定

2 結(jié)果

2.1 gRNA的設計、擴增與與純化

根據(jù)評分和脫靶評估情況，最終選了3個gRNA打靶序列。分別為gRNA1: GGACCTTAAGAGCTGGGTCC; gRNA2: GCTTGTCCATCTCGTCGAAG; gRNA3: TCTCTTCCTCTTCGACGAGA。用以上序列替換正向引物中的N(TGTAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-gttttagagctagaaatagc)gRNA的擴增和轉(zhuǎn)錄均按試劑盒數(shù)說明進行，純化回收良好。

2.2 gRNA的引導酶切效率的鑒定

結(jié)果顯示, gRNA2和gRNA3引導的Cas9酶切效率比較理想, gRNA1效果不佳(圖1)。這提示在體內(nèi)實驗時, gRNA2和gRNA3可能是更為理想的選擇。

3 討論

CRISPRs廣泛分布于細菌和古菌基因組中的一種序列[17]。研究[18,19]證實CRISPR通過產(chǎn)生RNA(crRNA)與CRISPR-associated protein相結(jié)合形成識別催化結(jié)構(gòu)，識別外源DNA序列并通過切除突變的方式達到防御自身的作用，又稱CRISPR防御體系?？茖W家將crRNA和轉(zhuǎn)錄激活transactivating RNA(tracrRNA)，它們一起形成雙鏈RNA并與Cas9結(jié)合，由RNA識別DNA序列驅(qū)動Cas9定位后，由 Cas9內(nèi)切酶對基因組DNA進行切割[1]。雖然CRISPR/Cas9技術(shù)的切割效率很高，而且對于gRNA設計的要求也不高，但研究人員往往面臨如何篩選多條符合基因打靶要求的gRNA。篩選一條或幾條有效的gRNA, 也是實驗進行順利的保證[8,9]。

本文根據(jù)以往經(jīng)驗建立的這種體外篩選方法，不需特殊儀器和試劑，實用性強。通過將設計好的gRNA轉(zhuǎn)錄后，與含目的打靶片段的PCR產(chǎn)物，Cas9酶共同體外反應，篩選其指導酶切的效率。相比轉(zhuǎn)染細胞后再進行篩選，受精卵或胚胎顯微操作后培養(yǎng)至囊胚再基因組擴增并測序等檢驗策略，本方法更簡單易行，適合初步篩選[20]。而且判定方法也簡單，不需要特殊儀器和試劑，可以在不同研究層次的實驗室進行。本文中，我們以針對家兔TOR2A基因的gRNA設計與檢測的過程為例，闡述了該種方法。關(guān)于gRNA的體外篩選方法，也可在培養(yǎng)細胞系來進行，但往往需要熒光檢測儀器，對于一些實驗室來說不是很方便，而且實驗成本高。本文闡述的方法，實驗條件限制小，可操作強，可作為基因打靶g(shù)RNA的體外篩選，是細胞系篩選的有益補充, 也是后期在體實驗的保證。

當然, 本法是在體外/細胞外進行的篩選, 其反應條件與體內(nèi)存在一定差異。但基于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效率和高特異性，經(jīng)過本法篩選后，基本達到了實驗要求。尤其是在排除相對低效的gRNA方面，有很重要意義。根據(jù)我們的后期體內(nèi)實驗也基本驗證了初篩的效果。例如，在制作腺苷酸環(huán)化酶9(ADCY9)基因敲除兔時，通過體外篩選后，我們對新生仔兔體內(nèi)驗證表明其敲除率為76.5% (數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

綜上所述，我們描述了一種快速體外篩選gRNA引導Cas9酶切效率的方法，該方法簡單可行，為研究者篩選gRNA提供了便利。

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