吳劉成, 楊文杰, 范海華, 易劍峰, 田家瑋, 史祎敏, 蔣茂榮

(南通大學(xué)1. 實驗動物中心, 2. 醫(yī)學(xué)院, 3. 杏林學(xué)院, 南通 226001)

現(xiàn)代社會高速發(fā)展，社會節(jié)奏加快，事故、損傷、地震、疾病等導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的人數(shù)也在逐年增多，對個人和社會帶來很大的負(fù)擔(dān)，神經(jīng)損傷的修復(fù)始終受到大家的重視。外周神經(jīng)缺損之后的修復(fù)具有重要意義，關(guān)系到橋梁性作用、趨化作用和微環(huán)境作用[1]。神經(jīng)修復(fù)過程異常復(fù)雜并且目前技術(shù)有限, 而隨著人類基因組序列完成測序，2002年12月小鼠的基因組草圖也順利完成，為深入研究基因與周圍神經(jīng)再生的分子生物學(xué)機制奠定基礎(chǔ)。短尾小鼠是由乙基亞硝基脲(ENU)誘變獲得，穩(wěn)定遺傳的Brachyury基因突變小鼠，被命名為B6-St(B6-Short tail)小鼠[2]，小鼠的髓鞘結(jié)構(gòu)有松散、缺失、混亂的跡現(xiàn)。從短尾小鼠脊髓外觀表型完好，與正常小鼠無差異，但神經(jīng)元密度低于正常小鼠[3]。本文旨在通過分別建立兩種小鼠的坐骨神經(jīng)夾傷模型，研究神經(jīng)被夾傷以后小鼠的行走軌跡, 神經(jīng)肌肉形態(tài)變化及電生理等相關(guān)指標(biāo), 比較研究C57BL/6小鼠與B6-St小鼠外圍神經(jīng)的再生能力，探討B(tài)rachyury基因與周圍神經(jīng)再生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 清潔級B6-St小鼠為實驗組，C57BL/6小鼠為對照組，每組各10只，體質(zhì)量(20±2) g，雌雄各半，由南通大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(蘇)2014-0001]。本實驗所有動物操作均符合實驗動物福利要求，并通過南通大學(xué)實驗動物倫理委員會審查。

1.1.2 主要儀器與試劑 Leica DMR正置研究級熒光顯微鏡、冷凍切片機(Leica CM1900), 購自德國Leica公司; MYTO肌電圖誘發(fā)電位儀，購自意大利Esaote 公司; 戊巴比妥鈉(Cat. No.: P3761-25g), 購自美國Sigma公司; 伊紅(Cat. No.: E607321)和蘇木素(Cat. No.: E607317), 購自生工生物(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備坐骨神經(jīng)夾傷模型 術(shù)前1 d下午起小鼠禁食。手術(shù)當(dāng)日按體質(zhì)量隨機分組，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%戊巴比妥鈉麻，0.1 mL/20 g 體質(zhì)量，腹腔注射。深度麻醉后，小鼠大腿左股部手術(shù)區(qū)域備皮，參考蔣茂榮等[4]方法制備坐骨神經(jīng)夾傷模型。

1.2.2 足跡實驗 手術(shù)后在外部條件相同的環(huán)境中小鼠恢復(fù)適應(yīng)一段時間后進行足跡實驗, 檢測小鼠術(shù)后8 d、12 d、16 d恢復(fù)情況, 按照常規(guī)足跡試驗測量并記錄足印長度(PL)、足趾寬度(TS)、中間足趾寬度(IT)。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic function index, SFI)以0為正常值, -100為神經(jīng)完全斷離的指標(biāo)。SFI =38.3×[(EPL-NPL)/NPL]+109.5×[(ETSNTS)/NTS]+13.3×[(EIT-NIT)/NIT]-8.8, 公式中E表示傷側(cè)足, N表示正常足。

1.2.3 電生理檢測 術(shù)后3周，對所有小鼠稱重并記錄小鼠體質(zhì)量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%戊巴比妥鈉麻(方法同上)，深度麻醉后，經(jīng)過外科手術(shù)暴露出小鼠坐骨神經(jīng)，分離出坐骨神經(jīng)，將記錄電極刺入腓腸肌，干擾電夾住小鼠膝部皮膚，刺激電極置于夾傷近處、遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)干，電刺激，檢測復(fù)合動作電位(CMAPs)，測量振幅和潛伏期。

1.2.4 取材及樣品處理 術(shù)后21 d，按照常規(guī)方法灌注固定。每組取2只小鼠并通過手術(shù)取下夾傷的坐骨神經(jīng)，坐骨神經(jīng)要求完整不能有破損，浸入預(yù)冷質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛4 ℃后固定，取出雙側(cè)完整腓腸肌，濾紙吸干其外表水分，稱量腓腸肌濕重，計算腓腸肌濕重比。

1.2.5 腓腸肌形態(tài)觀察 腸肌標(biāo)本經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛固定后，流水沖洗過夜; 酒精梯度脫水; 二甲苯透明; 浸蠟; 包埋; 石蠟切片; 按照常規(guī)的方法進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照保存。觀察腓腸肌細(xì)胞大小，是否有肌肉萎縮現(xiàn)象。

1.2.6 腓腸肌細(xì)胞形態(tài)計量分析 在6個染色完好的切面中隨機選取3個視野清晰的圖片, 用鉛筆標(biāo)注清楚細(xì)胞測量每個樣品在各個視野肌纖維的橫切面積(CSA), 并且數(shù)出視野內(nèi)共有多少細(xì)胞, 求平均值。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 計量數(shù)據(jù)用表示, 用STATA7軟件分析, 組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B6-St小鼠與C57BL/6小鼠SFI比較

由表1可見, 夾傷手術(shù)后8 d、12 d、16 d兩組小鼠SFI值不斷增加, 神經(jīng)呈緩慢恢復(fù)趨勢, 組內(nèi)不同時間點神經(jīng)功能恢復(fù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),但兩組小鼠間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表 1 兩組小鼠SFI比較Table 1 Comparison of sciatic function index of sciatic nerve between the two group mice

2.2 B6-St小鼠與C57BL/6小鼠坐骨神經(jīng)電生理學(xué)比較

術(shù)后21 d, 對坐骨神經(jīng)夾傷處電刺激時，兩組小鼠近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端的CMAPs呈規(guī)律的波幅變化(圖1)，C57BL/6小鼠與B6-St小鼠CMAPs振幅分別為(4.35±3.29) mV和(4.62±2.77) mV(P＞0.05)。

圖 1 電刺激對坐骨神經(jīng)夾傷小鼠CMAPs的影響Figure 1 Effect of electrical stimulation on compound muscle action potentials (CMAPs) of sciatic nerve injury mice

2.3 B6-St小鼠與C57BL/6小鼠腓腸肌濕重比比較

術(shù)后21 d， C57BL/6小鼠與B6-St小鼠腓腸肌濕重比分別為446.31±48.35和467.18±60.51(P＞0.05)提示神經(jīng)損傷后，肌肉有失神經(jīng)肌萎縮現(xiàn)象，兩組小鼠肌肉萎縮程度相似。

2.4 B6-St小鼠與C57BL/6小鼠腓腸肌肌纖維橫截面積的比較

病理切片觀察顯示, 兩組小鼠肌肉橫切面幾乎接近圓形, 大小相比較也都比較接近，沒有忽大忽小的細(xì)胞形態(tài)。肌纖維分布較為均勻，細(xì)胞核和質(zhì)位置分布明顯，位于肌細(xì)胞膜下方靠近邊緣位置(圖2); 這兩組小鼠腓腸肌肌纖維CSA均為450 μm2左右(P＞0.05)。

3 討論

圖 2 兩組小鼠腓腸肌HE染色Figure 2 The HE staining of gastrocnemius muscle in two group mice

短尾小鼠(B6-St)是通過ENU誘變獲得的穩(wěn)定遺傳突變系小鼠，該小鼠17號染色體Brachyury基因突變, 小鼠出生后僅有1cm左右的尾牙[5]。B6-St小鼠表型遺傳穩(wěn)定，突變基因及位點確定，是研究遺傳性疾病和基因功能的極好載體。人類Brachyury基因定位于染色體6q27區(qū)域，編碼一種屬于T-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員的Brachyury蛋白，Brachyury蛋白的轉(zhuǎn)錄活性在中胚層發(fā)育和脊索的形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Brachyury突變體的胚胎干細(xì)胞從原條向外遷移的能力受損，在細(xì)胞黏附中起促進作用[6]。小鼠脊柱異常，脊髓向外發(fā)出許多周圍神經(jīng)，而對于周圍神經(jīng)的再生是否有一定的關(guān)聯(lián)，尚未有關(guān)報道。而且B6-St小鼠脊髓灰質(zhì)的前角運動神經(jīng)元數(shù)目較少，低密度的神經(jīng)元可能延緩損傷神經(jīng)的修復(fù)，通過比較這兩種小鼠的差異，探討可以快速修復(fù)受損神經(jīng)的方法。

SFI是評估坐骨神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的一個重要參考指標(biāo)，可反映下肢夾傷后肌肉恢復(fù)情況及下肢各肌肉的協(xié)調(diào)功能[7]。小鼠夾傷后分別在8d、12 d、16 d時實驗，測量損傷測和正常測的足印長度、足趾寬度、中間足趾寬度，數(shù)據(jù)統(tǒng)計得到SFI。結(jié)果顯示，兩組小鼠SFI值隨著術(shù)后恢復(fù)時間的延長而逐漸增加，神經(jīng)功能逐漸轉(zhuǎn)好，兩組恢復(fù)成度基本趨于一致。

電生理技術(shù)通過檢測神經(jīng)傳導(dǎo)過程中的動作電位，深入研究神經(jīng)傳導(dǎo)及功能的重要研究方法，常用于評定周圍運動神經(jīng)傳導(dǎo)功能[8]。而B6-St小鼠與C57BL/6小鼠夾傷后CMAPs無明顯差異，CMAPs的振幅與神經(jīng)纖維支配靶肌的神經(jīng)纖維數(shù)成正比，是神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)的重要參考，而兩組CMAPs值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

由于周圍神經(jīng)對靶結(jié)構(gòu)發(fā)揮一定營養(yǎng)支持作用，在神經(jīng)夾傷后，靶結(jié)構(gòu)在失去支配后會出現(xiàn)肌肉萎縮[9]。腓腸肌濕重比是體現(xiàn)失神經(jīng)支配腓腸肌萎縮程度的重要指標(biāo)，通過腓腸肌肌肉濕重比實驗數(shù)據(jù)可知夾傷坐骨神經(jīng)后，肌肉出現(xiàn)明顯的萎縮癥狀，而兩組小鼠之間肌肉濕重比無明顯差異，肌肉萎縮程度相類似。

綜上所述，B6-St小鼠與C57BL/6小鼠坐骨神經(jīng)夾傷后周圍神經(jīng)各項功能相似，Brachyury基因突變后對小鼠外周神經(jīng)的再生作用不明顯，但是該基因?qū)顾璧陌l(fā)育調(diào)控尚需要進一步的研究。

參考文獻：

[1] Jiang M, Zhuge X, Yang Y, et al. The promotion of peripheral nerve regeneration by chitooligosaccharides in the rat nerve crush injury model[J]. Neurosci Lett, 2009, 454(3):239.

[2] 邵義祥, 陳兵, 張成香, 等. ENU誘導(dǎo)獲得一種短尾小鼠及其突變基因的初步定位[J]. 動物學(xué)雜志, 2005, 40(1):8-13.

[3] 王生存, 繆進, 劉春, 等. 短尾小鼠脊柱發(fā)育形態(tài)與病理生理學(xué)研究[J]. 交通醫(yī)學(xué), 2012, 26(6):527-529.

[4] 蔣茂榮, 諸葛曉旻, 丁斐. 殼寡糖促進小鼠坐骨神經(jīng)再生的實驗研究[J]. 蘇州大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版, 2010, 30(1):4-6.

[5] Wu B, Shao Y, Chen B, et al. Identification of a novel mouse brachyury (T) allele causing a short tail mutation in mice[J].Cell Biochem Biophys, 2010, 58(3):129-135.

[6] Conlon FL, Smith JC. Interference with Brachyury function inhibits convergent extension, causes apoptosis, and reveals separate requirements in the FGF and activin signalling pathways[J]. Dev Biol, 1999, 213:85-100.

[7] Fekrazad R, Mortezai O, Pedram M, et al. Transected sciatic nerve repair by diode laser protein soldering[J]. J Photochem Photobiol B, 2017, 173:441-447.

[8] Sun X, Zhang Z, Liu N. Absence of split hand in the flail arm variant of ALS[J]. Neurophysiol Clin, 2016, 46(2):149-152.

[9] 邵晨昕, 吳欣, 劉梅, 等. Myostatin在小鼠腓腸肌失神經(jīng)支配萎縮過程中的表達(dá)[J]. 解剖學(xué)雜志, 2006, 29(2):146-149.