賈森泉 , 金 曉, 李曉紅, 王海璇, 胡凝珠, 胡云章

(1. 昆明醫(yī)科大學, 昆明 650500; 2. 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所云南省蟲媒傳染病防控研發(fā)重點實驗室, 昆明 650118）

疫苗作為人類抵抗疾病的武器，從傳統(tǒng)的病毒疫苗到現(xiàn)在的亞單位、DNA疫苗，發(fā)展十分迅速。疫苗佐劑作為增強疫苗免疫效果的物質(zhì)，隨著疫苗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對其的研究也越來越受到重要。傳統(tǒng)疫苗佐劑雖然使用廣泛，但仍具有一些局限性和副作用，如鋁佐劑可能導致淋巴疾病和神經(jīng)毒性[1]，因此研發(fā)新型疫苗佐劑具有重要意義。

卡拉膠(carrageenan)是從海藻中提取的天然硫酸多糖, 廣泛應用于食品行業(yè)?？ɡz具有炎癥刺激作用, 被用于各種炎癥模型構建[2], 不僅能促進巨噬細胞增殖、增強巨噬細胞吞噬能力、腫瘤壞死因子α(TNF-α)分泌，還能通過上調(diào)Toll樣受體4(TLR4)表達進而激活核因子 κB(NF-κB)途徑[3]。同時也有研究表明卡拉膠能夠通過與白細胞介素-8(IL-8)結合來刺激TLR4-BCL10介導的固有免疫反應[4,5]。并且已有研究表明對其進行修飾后,其免疫活性更高[6]?？ɡz還具有抗HIV、HSV等病毒的抗病毒作用[7]。硒位于金屬元素與非金屬元素之間, 不僅是營養(yǎng)物質(zhì)，而且對機體免疫也有重要影響[8]。硒多糖具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多種生理特性，且硒化后多糖活性能提高[9]。硒化卡拉膠(kappa-selenocarrageenan, KSC)是由卡拉膠與無機硒(亞硒酸鈉、亞硒酸、硒粉)通過酸解或酶解化學合成的, 一種新型的有機硒化合物，保留并增強了卡拉膠的生物活性。硒化卡拉膠不僅可以作為硒補充劑，還可增強T、B細胞增殖、增強腹腔巨噬細胞釋放的TNF的活性[10]及增加自然殺傷性細胞(NK細胞)活性[11]，現(xiàn)在也被用于抗乙型肝炎病毒、肝癌的治療[12]。

綜上所述, 本實驗選取KSC作為研究對象，研究其在甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-1)誘導的小鼠體液免疫中是否具有佐劑效應。

1 材料與方法

1.1 疫苗抗原

甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)，甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度為256 EU/mL，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供。

1.2 實驗動物

清潔級雌性 ICR 小鼠共 49 只，5～7 周齡，體質(zhì)量 18～22 g，由昆明醫(yī)學生物學研究所小動物試驗部提供[SCXK(滇)K2014-0002]。實行的全部實驗流程嚴格遵照昆明醫(yī)學生物學研究所動物實驗倫理委員會的要求。并按實驗動物使用的 3R 原則給予人道關懷。

1.3 主要試劑

間接酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒(抗小鼠ABT System)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠 IgG均購自美國KPL公司; KSC(99%)購自深圳安泰生物科技有限公司; 鋁佐劑為Al(OH)3膠體(12.5 mg/mL), 由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所疫苗研究室提供。

1.4 方法

1.4.1 分組與免疫 49只ICR隨機分成7組，陰性對照組(生理鹽水)、單純抗原組(18EU HepA-1)、鋁佐劑組[(Al(OH)30.3 mg+18EU HepA-1)]以及4個KSC組(KSC1mg+18EU HepA-1、KSC0.5 mg+18EU HepA-1、KSC 0.25mg+18EU HepA-1、KSC0.1mg+18EU HepA-1)每只小鼠注射量0.3 mL，皮下多點注射，免疫1次。

1.4.2 ELISA試劑盒測抗體滴度 于免疫后4周、8周、12周、16周尾靜脈采血, 取血清做抗體實驗。按操作說明書要求, 用間接酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測特異性抗HAV IgG抗體, 取 HAV 抗原, 加入96 孔板中, 100 μL/孔, 4 ℃包被過夜; 以 BSA 37 ℃封閉 1 h; 洗板 3 次, 加入倍比稀釋的小鼠血清(起始稀釋倍數(shù)為1 ∶ 20), 100 μL/孔, 37 ℃孵育1 h; 洗板3 次, 加入HRP標記的羊抗鼠 IgG (1∶400稀釋),100 μL/孔, 37 ℃孵育 1 h; 洗板 3 次, 加入 TMB 顯色液,100 μL/孔, 顯色 5 min; 加入 2 mol/L H2SO4, 100 μL/孔,終止反應。結果用雙波長法在酶標儀 405 nm 和655 nm 波長處測試每孔吸光度(A)值，待測血清的抗體效價是出現(xiàn)陽性反應的最大稀釋度(x)，根據(jù)ELISA 結果對組內(nèi)每只小鼠的滴度取幾何平均數(shù)，用以下公式計算抗體幾何平均滴度:

G為抗體幾何平均滴度; 1，2…n為觀測值; 為觀測數(shù)量。結果以表示。

1.5 安全性試驗

飼養(yǎng)期間觀察各組小鼠身體活動情況，毛發(fā)、行為是否發(fā)生改變，注射部位是否發(fā)生病變。于免疫16周后取KSC最佳劑量組及陰性對照組小鼠心臟、 肝臟、 脾臟、肺臟、腎臟組織，制備病理切片, HE染色, 顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計分析

利用 Graphpad prism 5 軟件分析數(shù)據(jù)的差異性，組間差異比較采用t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組別小鼠血清中抗HAV IgG 滴度比較

由圖1中可知，除陰性對照組外其余各組均產(chǎn)生抗HAV IgG抗體, 且存在抗體滴度先升高后降低的趨勢, 除鋁佐劑對照組在免疫后12周達到峰值外,其余各組在8周達到峰值。不同劑量KSC組在同一時間抗體水平不同, 在8周, 12周KSC 0.5 mg組抗體水平高于單純抗原組(t=3.103,t=2.573,P＜0.05)。免疫后8周鋁佐劑組抗體水平高于單純抗原組、KSC 0.1mg組(t=2.440,P＜0.05;t=5.303,P＜0.001),KSC 0.5 mg組抗體水平高于KSC 0.1 mg組(t=6.023,P＜0.0001), KSC 0.5 mg組抗體水平略高于鋁佐劑,其余各組與單純抗原組相當。免疫后12周鋁佐劑組抗體水平高于單純抗原組、KSC 0.1mg組(t=6.504、t=5.774，P＜0.0001), KSC 0.25 mg組抗體水平高于單純抗原組(t=2.602,P＜0.05), KSC 0.5 mg組略低于鋁佐劑組，其余各組與單純抗原組相當。16周鋁佐劑組抗體水平高于單純抗原組、KSC 0.1 mg組(t=2.666、t=2.641,P＜0.05)。綜上所述，選取KSC劑量0.5 mg為本次實驗的最佳劑量。

2.2 安全性試驗

實驗期間，各組小鼠進食、 飲水、毛色和排泄均正常，無脫毛、蜷縮、抽搐、痙攣、水腫及休克等異?，F(xiàn)象，注射部位也均無異常。顯微鏡下觀察顯示，KSC 0.5 mg 組和陰性對照組小鼠心臟、 肝臟、 脾臟、 肺臟、 腎臟組織均未觀察到病變(圖2)。表明硒化卡拉膠安全性良好。

圖1 免疫后不同時間各組抗HAV IgG抗體滴度(lgG)Figure 1 Anti-HAV IgG antibody titer in different times after immunization (lgG)

3 討論

隨著生物學技術的迅速發(fā)展，新型疫苗如合成肽疫苗、 亞單位疫苗和核酸疫苗的應用日益廣泛，與老一代疫苗(減毒活疫苗、 滅活疫苗)相比，新型疫苗具有純度高、特異性強等優(yōu)點, 但其分子小, 免疫原性較差, 難以產(chǎn)生有效的免疫應答［13］,因此, 需免疫佐劑的輔助。 傳統(tǒng)疫苗佐劑如鋁佐劑，雖然是美國FDA 批準的人用疫苗中最安全的佐劑,具有成本低、安全、免疫應答持續(xù)時間長等優(yōu)點,但也具有不適用于重組蛋白和亞單位疫苗，誘導的黏膜反應、細胞免疫應答不足，且注射部位易引起結節(jié)、紅腫、紅斑、形成肉芽腫和皮下結節(jié)等缺點[14], 因此, 研發(fā)新型疫苗佐劑具有重要意義。

圖 2 陰性對照組和 KSC 0.5 mg 組小鼠各臟器組織的病理觀察(HE× 10)Figure 2 Pathological changes in various organs of mice in negative control and KSC 0.5 mg groups (HE staining ×10)

新型疫苗佐劑的研究要求佐劑除了具有無毒、可降解、 無致免疫性和可再生外，還需要對抗原具有持久的、 高效的免疫應答反應。研究表明多種天然多糖具有良好的免疫促進作用， 能提高體液免疫和細胞免疫，如刺激樹突狀細胞(dendritic cells,DC)的分化成熟，提高其抗原提呈能力[15]、刺激巨噬細胞釋放細胞因子[16]、能夠引起機體Th1、Th2型免疫反應等，而且由于其自身具有天然、低毒、無藥物殘留等優(yōu)點, 以及在使用安全性方面的優(yōu)勢, 已成為疫苗佐劑研究的一個熱點。目前報道[17,18]已有多種多糖被研究用作免疫佐劑。隨著對多糖的研究, 多糖衍生物也受到關注。有研究[19]表明對多糖進行合適的離子、基團等修飾, 能夠大大提高其生物活性。目前多糖的修飾主要有硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙?；?、烷基化、硒化修飾等方式，通過這些方式能人為的提高其利用度和活性，如適當硫酸化修飾板藍根多糖后其免疫活性高于未修飾的板藍根多糖[20]。KSC膠集硒與卡拉膠的優(yōu)點于一體，不僅僅是兩者活性的簡單相加，其對免疫增強作用也很明顯; 可增強T淋巴細胞增殖能力、單核巨噬細胞吞噬功能、升高血清半數(shù)溶血素值, 增強B淋巴細胞增殖能力及IL-1、IL-2活性[21]等。因此其可能作為一種新型佐劑。

本實驗將不同劑量的KSC與HAV疫苗(HepA-1)混合免疫小鼠, 研究其是否能增強體液免疫反應。通過實驗表明, KSC能夠有效提高HAV抗原誘導的小鼠體液免疫反應，抗體持續(xù)時間較長。實驗中KSC 0.5 mg組在免疫后8周、12周抗體水平較高,與鋁佐劑組相當, 顯著高于單純抗原組，且安全性良好，這些結果與本課題組之前的多糖衍生物低分子量肝素鈉作佐劑的研究結果相似[22]，表明KSC可以開發(fā)為新型疫苗佐劑。下一步應對其進行優(yōu)化及復合佐劑、細胞免疫研究。

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