李曉紅, 金 曉, 賈森泉, 胡凝珠, 胡云章, 李建芳

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室, 昆明 650118; 2. 昆明醫(yī)科大學(xué), 昆明 650500)

疫苗佐劑是當與抗原一起注射或預(yù)先注入機體時，可增強機體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的物質(zhì)，而本身無抗原性物質(zhì)[1,2]?？梢栽诿庖叻磻?yīng)低下的人群( 如老人、兒童和免疫低下的人) 中誘導(dǎo)全面持久的免疫應(yīng)答。自20世紀初被發(fā)現(xiàn)以來，已有使用佐劑來改善以及增強疫苗對機體的免疫應(yīng)答，比如鋁佐劑。但鋁佐劑不適于重組蛋白和亞單位疫苗，也會產(chǎn)生不良反應(yīng)，如炎癥，刺激局部產(chǎn)生紅斑，肉芽腫，皮下結(jié)節(jié)，接觸性皮炎，IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，鋁佐劑也不能誘導(dǎo)細胞毒性 T細胞應(yīng)答[3,4]。目前，盡管已經(jīng)有大量新型疫苗佐劑處于研究開發(fā)和臨床試驗階段，但是真正獲得批準用于人類疫苗的佐劑寥寥無幾。因此研發(fā)新型的疫苗佐劑在疫苗的研發(fā)中具有重要的作用。

壬二酸為9碳直鏈飽和二元酸, 亦稱為杜鵑花酸, 分子式為C9H16O4和(CH2)5(CH2COOH)2, 相對分子質(zhì)量為188.22, CAS注冊號為123-99-9, 化合物目錄數(shù)據(jù)庫EINECS號碼為204-669-1。壬二酸呈白色至微黃色單斜棱晶、針狀結(jié)晶或粉末。熔點98～103 ℃, 沸點286℃(100 mmHg), 閃點215 ℃, 蒸氣壓0.13 kPa(20 ℃), 相對密度 1.03(水 20 ℃), 微溶于冷水(2.4 g/L, 20 ℃), 溶于熱水、乙醚, 易溶于乙醇。

壬二酸是由共生酵母馬拉色菌(Malassezia furfur)天然產(chǎn)生的中鏈二羧酸，馬拉色菌是人類和許多其它動物的正常皮膚菌群的一部分，在人體中以低水平存在，攝入的食物來源如小麥，大麥和黑麥[5]。壬二酸是一種具有多種活性的復(fù)合分子，隨著對其臨床應(yīng)用的不斷認識，證實了壬二酸的抗炎、抗感染和抗菌作用[6]。目前，壬二酸在治療痤瘡、黑色素瘤、黃褐斑、酒糟鼻、色素過度沉著及硬化癥等方面得到了廣泛應(yīng)用[7]。已經(jīng)證明壬二酸通過幾種途徑調(diào)節(jié)正常人角質(zhì)形成細胞的炎癥反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體g和核因子(nuclear factor κB, NF-κB)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控細胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、IL-6等，這些細胞因子與免疫應(yīng)答相關(guān)，同時觀察到促炎細胞因子分泌的抑制作用[8]。壬二酸是體外酪氨酸酶和其他氧化還原酶的可逆抑制劑，抑制線粒體呼吸，也可以抑制厭氧糖酵解。 在體外和體內(nèi)，它對有氧和厭氧(丙酸桿菌)都具有抗菌作用。雖然抗菌活性的確切機制尚待完全闡明，但是壬二酸對代謝，酶活性和細胞內(nèi)pH都有影響。較低的環(huán)境pH也可能增強這種二羧酸的殺菌作用[6]。另外，壬二酸可以抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)從中性粒細胞的釋放，也可以通過直接清除作用減少ROS[9]。

目前尚未見關(guān)于壬二酸作為佐劑的相關(guān)報道。鑒于壬二酸具有抗菌及抗炎作用，以及抗腫瘤作用，不僅對黑素瘤細胞有抑制作用還對其他腫瘤細胞(如磷癌細胞)也有抑制作用[10]，推測其具備潛在的疫苗佐劑效應(yīng)。本文作者選擇壬二酸作為候選佐劑，探究在甲型肝炎減毒活疫苗中的佐劑效果。本實驗將壬二酸作為佐劑，觀察其對甲型肝炎抗原誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響，以此評價壬二酸的佐劑效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-1)，甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度為256 EU/mL，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供; 甲型肝炎抗原(HAV顆粒)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供;鋁佐劑為Al(OH)3膠體(12.5 mg/mL)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供; 壬二酸購于瑞士Adamas-beta公司;血清IgG ELISA試劑盒，購自美國KPL公司。

1.2 實驗動物

清潔級雌性ICR小鼠共49只, 5～6周齡, 體質(zhì)量18～22 g, 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動物實驗部[SCXK(滇)K2014-0002]提供。實驗計劃通過醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動物實驗倫理委員會審查,動物飼養(yǎng)設(shè)施符合相關(guān)標準[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.3 動物分組及免疫

將49只雌性ICR小鼠隨機分成7組，7只/組，分組情況詳見表1。均經(jīng)背部皮下多點注射ICR小鼠, 300 mL/只(配制體系見表1)。于免疫后的4周、8周、12周和16周，小鼠尾靜脈采血，分離血清，以備檢測。

表 1 動物分組

1.4 小鼠血清抗-HAV IgG抗體水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測小鼠血清中抗HAV IgG抗體水平。按照ELISA試劑盒說明書操作, 于酶標儀405 nm和605 nm雙波長檢測各孔吸光度(A)值，陽性反應(yīng)孔的判定: cutoff值等于3個陰性對照孔平均A值乘以 2.1，大于cutoff值判定為陽性，小于或等于cutoff值判定為陰性，以陽性反應(yīng)孔的最大稀釋度作為該孔的抗體效價，以log10表示。

1.5 安全性試驗

實驗期間，對小鼠毛色、注射部位、飲食、體質(zhì)量等進行觀察，并記錄。取壬二酸與甲型肝炎減毒活疫苗共同免疫ICR小鼠的最佳劑量組及空白對照組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織，用甲醛固定液固定，沖洗后進行脫水、透明、浸蠟與包埋，石蠟切片，HE 染色觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以表示，應(yīng)用Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 佐劑的安全性

在實驗期間內(nèi)，所有小鼠飲食、活動均正常，各個實驗組之間小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，小鼠均未出現(xiàn)松毛、縮團、發(fā)抖等異常反應(yīng)，注射部位也無異常[3]，實驗結(jié)束后小鼠無死亡。組織切片觀察均未觀察到病變(圖1)。表明壬二酸在免疫劑量范圍內(nèi)，壬二酸佐劑安全無毒。

2.2 不同組別小鼠血清中抗HAV-IgG抗體水平

除空白對照組外，各組小鼠在免疫后4周、8周、12周、16周, 均產(chǎn)生抗HAV-IgG, 且抗體水平隨免疫后時間的延長均先升高而后降低; 在免疫后8周、12周，各組小鼠血清中抗HAV IgG抗體水平達到峰值，免疫后16周小鼠抗HAV IgG抗體水平又有所下降。在免疫后4周，佐劑組1(壬二酸0.5 mg劑量)小鼠抗HAV IgG抗體水平均高于單純抗原組(P＜0.05、t=2.640); 佐劑組4(壬二酸3 mg劑量)小鼠抗HAV IgG抗體水平均高于單純抗原組和鋁佐劑組(均P＜0.05),t值分別為3.134、2.388。在免疫后8周、12周，佐劑組4小鼠產(chǎn)生的HAV IgG抗體水平均高于單純抗原組(均P＜0.05)，t值依次為2.751、2.743。鋁佐劑組在免疫后8周和12周，小鼠抗HAV IgG抗體水平均達到峰值, 與單純抗原組相比均P＜0.01，t值依次為3.699、4.322(圖 2)。

3 討論

鋁佐劑作為經(jīng)典的佐劑已被廣泛用于人類疫苗接種[11], 但誘導(dǎo)的黏膜反應(yīng)、細胞免疫應(yīng)答不足，且接種部位可形成瘙癢結(jié)節(jié)，包括無菌性膿腫、紅斑、皮下結(jié)節(jié)、肉芽腫炎癥和接觸性超敏反應(yīng)，更為嚴重的是鋁佐劑有讓人體發(fā)生神經(jīng)退行性病變的可能[12-14]。乳劑類佐劑常見的副作用有注射部位的炎癥反應(yīng)、肉芽腫、潰瘍等，對于人類常規(guī)的預(yù)防性疫苗來說毒性太大，只能用于科學(xué)研究或癌癥患者[15]。脂質(zhì)體雖然可以誘導(dǎo)體液免疫和誘導(dǎo)細胞免疫，但是其穩(wěn)定性低、成本高，不適宜大批量生產(chǎn)，并且在注射部位可能引起疼痛[16]。皂苷(QS-21) 能針對HIV-P 和其他病原體可以誘導(dǎo)強烈的細胞反應(yīng)[17]，但是毒性較大，不適用于大多數(shù)人群。因此研發(fā)新型的疫苗佐劑非常重要。

已有臨床研究證實:壬二酸長期應(yīng)用后相當安全、副作用小、無致畸性、無全身不良反應(yīng)、病人的耐受性較好，而且壬二酸還有獨特優(yōu)勢，壬二酸不是抗生素，所以不會出現(xiàn)細菌耐藥[18-20]。局部使用壬二酸在妊娠中被證明是安全的，因此被歸類為B類藥物; 在哺乳期間，該藥物也可以安全使用[5]。用于本實驗的小鼠并無傷亡，病理切片觀察均未觀察到病變，進一步說明了壬二酸作為佐劑使用的安全性。并且壬二酸制作容易，價格低廉。本實驗為了探究壬二酸作為新型疫苗佐劑的可行性，將不同劑量的壬二酸與一定劑量的甲型肝炎減毒活疫苗多點皮下注射到ICR小鼠，初步研究其對HepA-1誘導(dǎo)的小鼠體液免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示，適當劑量的壬二酸可以顯著增強HepA-1誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，顯著高于單純抗原組，具有佐劑效應(yīng)。壬二酸有望成為HepA-1新型佐劑。實驗的下一步將細化壬二酸的劑量分組，進一步探究其作為佐劑的作用原理以及安全性和有效性。

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圖 1 小鼠各臟器組織的病理學(xué)觀察Figure 1 Pathological changes in various organs of mice

圖 2 不同時間各組小鼠血清抗-HAV IgG水平Figure 2 Anti-HAV IgG titers in sera of mice among different groups at 4, 8, 12 and 16 weeks

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