孫靖諭, 謝靈志, 馮 潔, 于 寧, 錢 淼, 曹舒揚, 張 泉

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚州 225009; 2. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

嚙齒類螺桿菌(helicobacter rodentium)屬螺桿菌屬, 為革蘭氏陰性菌。自1992年Lee等首次從小鼠中分離到小家鼠類螺桿菌后, 目前已分離到至少13種嚙齒類動物螺桿菌[1], 其中膽汁螺桿菌(helicobacter bilis)、肝螺桿菌(helicobacter hepaticus)、嚙齒類螺桿菌為較重要的感染嚙齒類動物的螺桿菌[2], 主要存在于消化道，包括盲腸、結(jié)腸以及肝膽等器官[3]。嚙齒類螺桿菌會引起動物疾病，更易以隱性感染形式存在于免疫缺陷型動物中, 實驗小鼠感染嚙齒類螺桿菌會導(dǎo)致肝炎、盲腸結(jié)腸炎等多種腸肝疾病[4], 混合感染嚙齒類螺桿菌和膽汁螺桿菌會引起腹瀉[5]。因此，若在科研或生物安全性評價等試驗中采用此類實驗動物，會對實驗數(shù)據(jù)造成影響，結(jié)果缺乏可靠性。

由于螺桿菌屬的細(xì)菌需在微氧環(huán)境中生長，營養(yǎng)要求嚴(yán)苛，生長周期長，且菌落、菌體形態(tài)差異小，細(xì)菌的培養(yǎng)鑒定有一定困難[6]。熒光定量PCR是將PCR技術(shù)和光譜技術(shù)相結(jié)合的一種核酸定量檢測技術(shù)，具有更好的靈敏度[7]。16S rRNA具有高度保守穩(wěn)定的特性，被稱為細(xì)菌界的“分子化石”[8]，在分子診斷和遺傳進化分析中具有獨特的優(yōu)勢。本研究以SYBR Green Ⅱ為熒光染料，以16S rRNA為靶基因，建立嚙齒類螺桿菌的熒光定量PCR快速檢測方法，以期為實驗動物的病原微生物診斷提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品檢測

嚙齒類螺桿菌、肝螺桿菌、膽汁螺桿菌基因組DNA由上海實驗動物研究中心提供，糞便樣品來源于江蘇省某實驗動物飼養(yǎng)單位的大、小鼠，共28份。

1.2 主要試劑

糞便基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司; SYBR Primer Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 公布的Helicobacterrodentium16S ribosomaL RNA基因序列(序列號：U96297.1)，設(shè)計一對引物正向: 5'-GAGATAGTGGAGTGCTAGC-3'; 反向: 5'-GCTCCATTTCACAATATTGC-3'，目的片段大小為268 bp。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 熒光定量PCR擴增與反應(yīng)條件優(yōu)化

采用SYBR Primer Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)進行體系優(yōu)化，以出現(xiàn)最高熒光值、最小循環(huán)數(shù)以及在溶解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性峰作為標(biāo)準(zhǔn)，進行熒光定量PCR條件篩選優(yōu)化。通過對SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR條件的優(yōu)化，確定反應(yīng)體系為20 μL，包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL, 上游引物(20 μmol/L)helicobacter rodentium-16S rRNA-F 0.2 μL, 下游引物(20 μmol/L)helicobacter rodentium-16S rRNA-R 0.2 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，DNA 模板 1 μL，H2O 8.2 μL。循環(huán)數(shù)為40次，反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s, 40 個循環(huán); 95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 15 s。繪制熔解曲線。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以gDNA為模板DNA, 通過普通PCR擴增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收試劑盒回收后, 與磷酸受納蛋白(PLB)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α, 篩選得到陽性菌落, 提取質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板并定量，利用公式N=(C×10-9)/(M×660)×6.02×1023進行拷貝數(shù)換算, 其中N為每微升標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù), C為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(ng/μL)，M為標(biāo)準(zhǔn)品堿基數(shù)。將標(biāo)準(zhǔn)品進行梯度稀釋，將3×102拷貝數(shù)/μL～3×107拷貝數(shù)/μL 6個稀釋濃度作為模板進行熒光定量PCR。以6個標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，實驗所得的Ct值為縱坐標(biāo)，進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.6 特異性試驗

以嚙齒類螺桿菌基因組DNA為陽性對照模板，膽汁螺桿菌、肝螺桿菌和彎曲桿菌DNA為陰性對照，雙蒸水為空白對照，通過熒光定量PCR進行實驗檢測，檢測該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

將標(biāo)準(zhǔn)品進行10 倍梯度稀釋后, 取濃度為3×100～3×107拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進行熒光定量PCR 檢測，同時做普通PCR 檢測。以確定熒光定量PCR和普通PCR的最低檢測濃度并進行敏感性比較。

1.8 重復(fù)性試驗

選取3×106拷貝/μL和3×104拷貝/μL的基因組DNA進行重復(fù)性熒光定量PCR實驗, 組內(nèi)試驗與組間試驗分別重復(fù)3次和2次, 記錄Ct值, 分別計算標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、組間變異系數(shù), 以此反映該方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性, Ct值大于34, 視為陰性。

1.9 樣品檢測

使用糞便DNA提取試劑盒提取28份糞便標(biāo)本DNA，根據(jù)如上所示的熒光PCR體系及程序，并設(shè)陽性及空白對照，同時進行常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR擴增與反應(yīng)條件優(yōu)化

將擴增后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳, 結(jié)果顯示所得到的片段大小與目的片段一致(268bp)(圖1)。產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析后顯示，與嚙齒類螺桿菌特異性目的片段的序列同源性達(dá)100%，確定為特異性目的片段。溶解曲線顯示，在86.61℃處出現(xiàn)特異性峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的峰值出現(xiàn)(圖2)。

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)品進行10 倍系列稀釋, 取3×102～3×107拷貝/μL 的6個梯度濃度的質(zhì)粒作模板，進行實時熒光定量PCR 擴增，制作動力學(xué)曲線(圖3)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.603 1，截距為38.306，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 9，結(jié)果顯示具有良好的線性關(guān)系。動力學(xué)曲線指數(shù)增長階段和平臺期都完整，熒光定量PCR的結(jié)果是可靠的。

圖 1 嚙齒類螺桿菌16S rRNA 特異目的片段的PCR擴增

圖 2 嚙齒類螺桿菌擴增溶解曲線

圖 3 熒光PCR擴增動力學(xué)曲線

圖 4 嚙齒類螺桿菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗

以建立的熒光法定量PCR體系檢測肝螺桿菌、膽汁螺桿菌、嚙齒類螺桿菌、彎曲桿菌，設(shè)雙蒸水空白對照，結(jié)果僅嚙齒類螺桿菌發(fā)生了特異性擴增，肝螺桿菌、膽汁螺桿菌、彎曲桿菌及空白對照均未發(fā)生任何擴增，說明該方法具有良好的特異性(圖 5)。

2.4 敏感性試驗

將標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍梯度稀釋后, 取濃度為3×100～3×107拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進行熒光定量PCR 檢測，同時做普通PCR檢測。多次實驗后，空白對照Ct值均大于34，即為陰性，熒光定量PCR 檢測方法可以檢測到30個拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品，而常規(guī) PCR 僅能檢測到 300 個拷貝 /μL 的標(biāo)準(zhǔn)品(圖6)，表明建立的嚙齒類螺桿菌實時熒光定量PCR 檢測方法具有較高的敏感性，比常規(guī)PCR至少高10 倍。

2.5 重復(fù)性試驗

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中的3×106拷貝/μL和3×104拷貝/μL兩個稀釋度的作為模板, 對這兩個稀釋度在不同時間段進行2次重復(fù)測定, 每次對同一模板同時進行2次重復(fù)測定及設(shè)置3個重復(fù)孔, 結(jié)果表明, 3×104拷貝/μL組內(nèi)變異系數(shù)為0.1660%和0.7951%，3×106拷貝/μL組內(nèi)變異系數(shù)為 1.2583%和1.0846%，3×104拷貝/μL和3×106拷貝/μL組間變異系數(shù)分別為0.6546%和1.6337%, 組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%，說明建立的熒光定量PCR檢測方法具有較好的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠。其中:變異系數(shù)(β)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/平均數(shù)(X)(表1)。

2.6 臨床樣品檢測

對28只實驗大、小鼠糞便DNA, 分別進行常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測, 結(jié)果常規(guī)PCR僅檢測出16號樣品感染嚙齒類螺桿菌，陽性對照條帶明顯, 其余檢測樣品及空白對照均呈陰性(圖7); 熒光定量PCR檢測出1號、2號和21號樣品感染嚙齒類螺桿菌, 陽性對照條帶明顯，其余樣品及空白對照均為陰性(圖8)。熒光定量PCR的檢出率高于常規(guī)PCR，靈敏度更高。

圖 5 嚙齒類螺桿菌熒光定量PCR特異性擴增曲線

圖 6 熒光定量PCR與常規(guī)PCR敏感性試驗

表 1 熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

3 討論

嚙齒動物螺桿菌在全球范圍內(nèi)廣泛存在。有報道[9]顯示，該菌對不同品系的大、小鼠均有感染，A/Jcr、SCID的感染率略高，同時對雄性的肝損傷略大于雌性。該菌大多以慢性感染的潛伏形式存在，但對于免疫缺陷動物或免疫力降低的正常動物，可表現(xiàn)為多類炎癥、腫瘤甚至死亡。嚙齒類螺桿菌的傳播途徑為“糞-口”途徑[10]，大多從離乳幼仔時期因攝入帶有螺桿菌的糞便開始感染，通過長期排便和空氣粉塵傳播進一步感染其他個體[11]，因此，對實驗動物進行螺桿菌檢測可保證科學(xué)研究的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性?，F(xiàn)階段，我國檢測螺桿菌的技術(shù)手段相對缺乏，因此，建立嚙齒類螺桿菌快速、準(zhǔn)確的診斷方法具有重要意義。

實時熒光定量PCR具有高敏感、特異性強、可重復(fù)、封閉式反應(yīng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點[12]。該方法簡化了瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟。本研究建立了嚙齒類螺桿菌的熒光定量PCR檢測方法, 具有很強的特異性，其重復(fù)性試驗的組內(nèi)變異系數(shù)的平均值為0.826%，組間變異系數(shù)的平均值為1.144%，顯示出了該方法具有良好穩(wěn)定性, 同時進行的敏感性試驗顯示出熒光定量PCR的靈敏度可達(dá)30拷貝/μL,明顯高于常規(guī)PCR。

圖 7 常規(guī)PCR臨床樣品檢測

圖 8 熒光定量PCR臨床樣品檢測

綜上所述，本實驗研究以SYBR GreenⅡ為熒光染料，可用于嚙齒類螺桿菌感染的快速診斷，并可以進行定量分析嚙齒類螺桿菌感染程度，此方法將為嚙齒類螺桿菌的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查等提供一種方便快捷的定量檢測技術(shù)。

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