李思琪, 尹海暢, 趙麗麗, 王怡平, 金建麗, 陳洪巖

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室, 哈爾濱 150069;2. 牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 牡丹江 157011)

鴨腸炎病毒 (duck enteritis virus, DEV)，又名鴨瘟病毒(duck plague virus, DPV), 是雙鏈線性DNA病毒，基因組大小約為150 kb，屬于皰疹病毒家族，皰疹病毒甲亞科，馬立克病毒屬。DEV形態(tài)呈球形，具有皰疹病毒的典型形態(tài)，包括核心、衣殼、外膜和囊膜四個部分。該病毒能夠感染多種水禽，導(dǎo)致嚴(yán)重的敗血癥性疾病，如鴨病毒性腸炎。該疾病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為水禽的血管損傷、消化道出血、黏膜損傷、淋巴器官受損以及其他退行性損傷。該疾病于1923年首次在荷蘭報道，隨后流行于多個國家和地區(qū)?？傮w來說，DEV分布廣泛、傳播迅速，并且有很高的死亡率和發(fā)病率。這種病毒對全球范圍的水禽業(yè)造成了重大影響。盡管已有許多關(guān)于DEV基因組生物學(xué)方面的報道，但關(guān)于DEV與宿主細胞相互作用的研究依然落后于其他皰疹病毒科家族成員[1]。

干擾素(interferon, IFN)是一類高活性多功能的糖蛋白, 是生物體內(nèi)一類古老因子, 具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制細胞分裂等多種作用[2]。IFN分為三大類: I 型IFN、II 型IFN和III 型IFN。II型IFN具有抗病毒、抗腫瘤、影響細胞生長等作用[3]。IFNγ屬于II型IFN，IFNγ是一種異型糖蛋白，它是由自然殺傷(NK)細胞、T細胞等細胞在多種免疫刺激下產(chǎn)生的[4]。

國內(nèi)外有關(guān)禽類IFN的研究已有一定的進展。龔永強等[5]利用原核表達系統(tǒng)成功表達鴨IFNα成熟蛋白，并證明該蛋白對鴨瘟強毒有抑制作用，為以后臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。豐宗洋等[6]成功表達了雞 IFNα蛋白并研究了其抗病毒效果。周浩等[7]研究了H9N2禽流感病毒(H9N2)、坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)、鵝細小病毒(goose parvovirus, GPV)對鵝I型和II型干擾素表達的影響,發(fā)現(xiàn)H9N2、TMUV、GPV孵育外周血淋巴細胞后,均能顯著上調(diào)IFNα、IFNγ的表達。代麗等[8]成功表達雞IFNγ蛋白并研究其抗新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)活性。Chen等[9]研究表明鴨IFN刺激物(duSTING)能夠誘導(dǎo)鴨Ⅰ型干擾素并在抵抗鴨瘟病毒中具有重要作用。Qian等[10]研究表明鴨IFN調(diào)節(jié)因子1(duIRF1)，誘導(dǎo)鴨胚成纖維細胞(duck embryo fibroblasts，DEF)產(chǎn)生IFN和IFN刺激因子(interferon stimulated genes, ISGs)，能夠有效抑制DEV、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)等病毒的復(fù)制。Cheng等[11]研究表明雞DNA病毒傳感蛋白DDX41(chDDX41)激活I(lǐng)FNβ信號通路依賴于IFN刺激物(STING)。Yao等[12]研究了北京鴨IFNλ的克隆和表達。Long等[13]研究表明IFNγ可以提高DNA疫苗保護鴨的效率。Narayan等[14]在研究解決鴨乙型肝炎病毒感染時, 表明在感染鴨的肝臟樣品中IFNγ表達量上調(diào)。

本實驗研究了DEV感染DEF誘導(dǎo)鴨IFNγ產(chǎn)生及其相關(guān)ISGs的激活情況，為深入研究DEV感染與宿主細胞相互作用提供了理論基礎(chǔ)，進而為水禽病的防控、凈化提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

DPV-CSC標(biāo)準(zhǔn)毒株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所; DEF細胞，本實驗室保存。

1.2 主要試劑

Total RNA KitI(美國Omega公司，R6834-1);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(中國TaKaRa公司，6210A); FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)(瑞士Roche公司, 04913914001);胰酶消化液(TR)(美國Gibco公司); Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM，美國Gibco公司，C11995500BT); Fetal Bovine Serum(FBS，美國Clark公司，F(xiàn)B25015)。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)Genbank上登錄的基因序列IFNγ(NM_001310417.1)、內(nèi)參基因(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)(XM_005016745)、抗黏液病毒基因(Myxovirus resistance, Mx)(KR025554)、2'-5'寡腺苷酸合成酶L(2'-5'oligoadenylates synthesis L, OASL)(KY775584.1)、DEAD框蛋白50(DEAD-box protein 50, DDX50)等分別設(shè)計熒光定量的PCR引物, 由博仕生物公司合成。引物序列如表1所示。

表 1 熒光定量PCR使用的引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.4 病毒感染步驟

制備DEF[15]，待單層DEF長到細胞孔的80%時，按照感染復(fù)數(shù)(MOI)=1的劑量接種DEV，分別在感染24 h、36 h、48h、60 h收集細胞，未感染細胞作為對照。

1.5 細胞總RNA提取

用Total RNA Kit I試劑盒提取感染細胞和未感染細胞的總RNA，按照說明書方法操作。

1.6 cDNA合成

按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser的說明書方法操作，將提取的細胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.7 實時熒光定量PCR

反應(yīng)體系(冰上操作): SYBR 10 μL，PCR 正向引物(濃度為 10 μmol/L) 0.5 μL，PCR 反向引物(濃度為 10 μmol/L) 0.5 μL, c DNA 2 μL，dH2O 7 μL，總反應(yīng)體積20 μL，反應(yīng)程序: 95 ℃, 5 min; 95 ℃，30 s; 52 ℃，30 s (IFNγ、MX 為52℃，OASL、DDX50為48 ℃); 循環(huán)反應(yīng)45次。每個樣品做三個復(fù)孔。運用公式: 2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參照Ct值，△△Ct=病毒感染實驗組△Ct -未感染對照組△Ct)對所測樣品Ct值進行計算。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。各組數(shù)據(jù)均以表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組細胞病變

從圖1可以看出，DEV感染DEF 48 h后，DEF的形態(tài)發(fā)生變化: 細胞透明度下降，胞質(zhì)顆粒增多，細胞濃縮、變圓，最后脫落(實驗組); 沒有感染的DEF形態(tài)正常(對照組)。

2.2 IFNγ的mRNA表達

DEV(MOI=1)感染DEF后，于 24 h、36 h、48 h和60 h分別收集細胞提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 檢測IFNγ mRNA水平。結(jié)果如圖2、表2所示: 病毒感染細胞組IFNγ mRNA 水平在24 h上調(diào)不顯著，但在36 h、48 h和60 h均顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。

圖 1 DEV感染DEF的結(jié)果(×200)Figure 1 The result of DEV infected DEF (×200)

圖 2 不同時間點IFNγ的mRNA 表達水平Figure 2 Detection of the mRNA levels of IFNγ at different time

2.3 ISGs mRNA表達水平

DEV感染DEF后，分別于36 h和48 h收集細胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA, qRT-PCR檢測各ISGsmRNA水平。結(jié)果如圖3所示, 病毒感染細胞組Mx、DDX50和OASLmRNA水平在36 h和48 h均顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討論

鴨病毒性腸炎是由DEV引起的一種急性、熱性、敗血型疾病[16]。其臨床表現(xiàn)以體溫顯著升高、兩腿酸軟無力等為主要特征。該病長期危害養(yǎng)鴨業(yè)，造成巨大經(jīng)濟損失。有報道[17]表明在H7N9 病毒感染健康鴨后，檢測出IFNγ水平的升高。II型干擾素在許多動物細胞內(nèi)具有抗病毒作用。DEV感染DEF，能否激活在抗病毒免疫中的II型干擾素應(yīng)答是值得研究探索的。

本研究中采用熒光定量PCR法檢測了DEV感染DEF后24 h、36 h、48 h和60 hIFNγ mRNA水平。結(jié)果顯示，病毒感染后細胞內(nèi)IFNγ mRNA水平在36 h、48 h和60 h均顯著升高。這一結(jié)果表明，DEV感染DEF激活了IFNγ的產(chǎn)生。IFN的抗病毒機制主要表現(xiàn)在其誘導(dǎo)細胞內(nèi)一系列IFN刺激基因(ISGs)的表達。這些抗病毒蛋白主要是通過激活細胞下游的蛋白或作用于病毒基因組而發(fā)揮抗病毒作用[18]。Mx蛋白是屬于GTPase超家族中的一員，具有抗病毒作用。Mx蛋白具有的三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域是其抗病毒作用的必須結(jié)構(gòu)[19]。Mx蛋白能夠抗多種病毒, 但具體的作用機制尚不清楚。IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的2'-5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)是重要的抗病毒蛋白。通過其催化產(chǎn)物激活核酸內(nèi)切酶RNaseL, 降解病毒RNA, 從而抑制病毒復(fù)制[20]。DEAD框蛋白家族的RNA解旋酶能夠調(diào)節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)，這項功能在許多基礎(chǔ)生物過程中起關(guān)鍵作用。 除了RNA代謝中的傳統(tǒng)功能之外, 已經(jīng)報道了DEAD框RNA解旋酶作為抗病毒先天免疫的介質(zhì),也是病毒復(fù)制的必需宿主因子[21]。因此，DEAD框RNA解旋酶家族成員在病毒感染期間起到促進或抗病毒的作用。我們對DEV感染的DEF中幾種ISGs，如Mx、OASL、DDX50 mRNA水平進行了檢測。結(jié)果表明，DEV感染DEF，誘導(dǎo)了Mx、OASL和DDX50的表達上調(diào)。

表 2 所測樣品的Ct 值及計算結(jié)果Table 2 Measured Ct value of the sample and calculated results

圖 3 各個ISGs的mRNA 表達水平Figure 3 Detection of the mRNA levels of ISGs

本研究證實了DEV感染DEF不同時間點能夠誘導(dǎo)II型IFN應(yīng)答，并且初步探索了其激活DEF中II型IFN應(yīng)答的機制。為深入研究DEV感染與宿主細胞相互作用提供了理論基礎(chǔ)，進而為水禽病的防控、凈化提供思路。

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