王崇義， 史訓忠， 孫正林

（1. 寧?？h第一醫(yī)院檢驗科，浙江 寧波 315600；2. 寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，浙江 寧波 315020）

流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）引起的急性呼吸道傳染病，是危害人類呼吸道的傳染病之一。流腦的主要傳染源是帶菌者[1]。Nm的攜帶率與流腦的流行有重要的關系，帶菌率調查主要采用細菌培養(yǎng)法檢測[2]。增強對流腦病原菌的監(jiān)測，建立高效的Nm檢測方法對流腦的臨床診斷有重要的意義[3]。流腦的常規(guī)診斷方法是從腦脊液和血液中分離出病原菌，但患者使用抗菌藥物治療后，病原菌的陽性率會顯著下降，因此亟需一個敏感、高效的方法來解決傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法的缺陷[4]。為此，本研究探討了實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測Nm的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2010年1月—2016年12月寧?？h第一醫(yī)院70例疑似流腦病例的雙份腦脊液標本，1份采用細菌培養(yǎng)法進行檢測，將標本置于消毒試管內，接種于巧克力平板上；另1份采用實時熒光定量PCR進行檢測，需將標本保存在生理鹽水中，置-20 ℃環(huán)境中。細菌培養(yǎng)法所用的儀器與試劑均購自法國生物梅里埃公司，lightcycler 480熒光定量PCR儀（瑞士羅士公司）；K30破裂儀（寧波立誠公司），3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Nm熒光定量PCR檢測試劑盒（上海之江生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)法 將腦脊液標本接種于巧克力平板上，于5%～10%CO2環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)24～72 h，選取Nm可疑菌落進行鑒定、分型和藥物敏感性試驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR 對腦脊液標本提取DNA，同時吸取180 μL標本，置于1.5 mL離心管中，震蕩混勻，11 544×g離心2 min，去除上清。將100 μL DNA加入沉淀液中，充分混勻，再置沸水浴10 min。最后再對其11 544×g離心5 min，取上清4 μL進行檢測。根據(jù)引物進行反應混合液的配制以及循環(huán)參數(shù)的設置，同時設置陽性和陰性對照。結果根據(jù)lightcycler 480熒光定量PCR儀和試劑盒說明書進行評價。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR與細菌培養(yǎng)法檢測Nm結果的比較

采用細菌培養(yǎng)法檢出Nm陽性49例，陽性率為70.00%；實時熒光定量PCR檢出Nm陽性67例，陽性率為95.71%，其中有49例細菌培養(yǎng)法與實時熒光定量PCR均為陽性，有18例細菌培養(yǎng)法為陰性而實時熒光定量PCR為陽性。實時熒光定量PCR檢測Nm的陽性率明顯高于細菌培養(yǎng)法（χ2=16.293 1，P=0.000 1）。見表1。

表1 實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法檢測Nm的結果

2.2 實時熒光定量PCR檢測Nm的特異性、陽性預測值和陰性預測值

實時熒光定量PCR檢測Nm的特異性為100%，無假陰性結果，陽性預測值為73.13%，陰性預測值為0.00%。見表2。

表2 實時熒光定量PCR和細菌培養(yǎng)法的檢測結果[例（%）]

2.3 實時熒光定量PCR的敏感性及線性范圍

采用實時熒光定量PCR檢測10倍系列梯度稀釋的標本，分析其敏感性。結果表明實時熒光定量PCR最低可以檢測到的Nm DNA濃度為103拷貝/mL。見圖1。

按照實驗要求對選取的模板進行10倍系列有效稀釋，并選取7個濃度（2×107～2×103拷貝/mL），同時采用實時熒光定量PCR檢測。結果表明在2×103～2×107拷貝/mL范圍內，與相應的Ct值有較好的相關性（r值分別為0.999 9、0.999 6、0.999 5、0.999 7）。因此，實時熒光定量PCR檢測Nm DNA的線性范圍為2×103～2×107拷貝/mL。

圖1 Nm實時熒光定量PCR曲線

3 討論

流腦是一種嚴重影響患者健康的冬、春季急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐以及頭痛等臨床癥狀。有研究表明，由Nm引起的腦膜炎時常伴隨著較高的死亡率，因此受到臨床的重點關注[5]。流腦患者通常伴隨發(fā)熱以及頭痛等臨床癥狀，對患者的確診通常需要從患者的腦脊液和血液中分離出Nm。Nm是引起流腦的病原體，其主要寄居在患者上呼吸道內，是一種革蘭陰性雙球菌，對干燥、寒冷以及陽光環(huán)境都十分敏感。相關研究表明，Nm置于室溫中3 h就會死亡[6]。

傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法檢測時間較長，Nm易在標本運輸過程中死亡，當患者接受抗菌藥物治療以及受其他非特異性因素的影響時，會引起細菌分離的失敗，降低細菌培養(yǎng)法的準確性[7]。有研究表明，細菌培養(yǎng)法分離鑒定Nm的敏感性不高，因此采用敏感性更高的檢測方法變得十分重要且意義重大[8-9]。近年來，敏感性和特異性較高的實時熒光定量PCR已被廣泛應用臨床檢測。該法的主要特點是：（1）采用了熒光標記的特異性探針，增強了PCR擴增的特異性[10]；（2）采用Ct值定量結果，能夠有效地定量PCR擴增指數(shù)增長期起始的拷貝數(shù)，避免平臺效應對結果的影響，增強方法的敏感性[11]；（3）使用全封閉反應，不需要電泳等PCR后期處理，能有效避免PCR產物造成的假陽性污染；（4）檢測過程中進行在線式實時監(jiān)測，測量結果直觀有效，自動化程度較高[12]。實時熒光定量PCR檢測Nm的敏感性和特異性高，經(jīng)濟成本低，為Nm的檢測提供了重要的技術手段，為正常人群Nm帶菌率的調查提供了新的方法，也為暴發(fā)流行時快速、低成本的診斷提供了相應的技術支持[13]。PCR技術能通過對流腦患者的腦脊液或血液標本進行擴增，以擴增出特異性DNA片段來診斷Nm感染[14]。實時熒光定量PCR應用了較高的光譜技術，同時應用了高敏感性的儀器檢測熒光，因而熒光定量PCR檢測技術的敏感性、特異性與細菌培養(yǎng)法相比都有較大的提升[15]。由此可見，熒光定量PCR檢測技術的自動化程度及準確度均較高，還能有效地解決污染問題，檢測時間短，在檢測某些臨床已使用抗菌藥物或保存不當?shù)臉吮?、監(jiān)控流腦的早期情況及疾病流行的實驗室快速診斷方面均有十分廣闊的應用前景[7]。

本研究結果顯示，實時熒光定量PCR檢測Nm的陽性率（95.71%）顯著高于細菌培養(yǎng)法（70.00%），二者的陽性符合率為70.00%，2種方法完全符合49例，另有18例細菌培養(yǎng)法為陰性而實時熒光定量PCR為陽性。這一現(xiàn)象說明實時熒光定量PCR的敏感性比傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法更高。同時，本研究結果還表明，實時熒光定量PCR的特異性達100%，無假陰性結果。

綜上所述，實時熒光定量PCR檢測Nm的敏感性高、特異性強，且快速、簡便，為流腦流行病學調查提供了一種快速、簡便的病原學診斷手段。

[1] 張力文，王宗潤，吳秀麗，等. 實時熒光定量PCR法檢測人糞便中雙歧桿菌方法的建立及評價[J]. 吉林大學學報（醫(yī)學版），2014，56（3）：686-691.

[2]PEDERSEN K S，OKHOLM E，JOHANSEN M，et al. Clinical utility and performance of sock sampling in weaner pig diarrhoea[J]. Prev Vet Med，2015，120（3-4）：313-320.

[3]熊長輝，楊夢，劉曉青，等. 腦膜炎奈瑟菌檢測及基因分群[J]. 中國公共衛(wèi)生，2015，31（5）：578-580.

[4]TOCQUEVILLE V，F(xiàn)ERRé S，NGUYEN N H，et al. Multilocus sequence typing ofMycoplasma hyorhinisstrains identified by a real-time TaqMan PCR assay[J]. J Clin Microbiol，2014，52（5）：1664-1671.

[5] 方莉，龍思琪，許媛，等. 實時熒光PCR法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J]. 重慶醫(yī)學，2013，42（32）：3950-3951.

[6]NYMOEN D A，HETLAND FALKENTHAL T E，HOLTH A，et al. Expression and clinical role of chemoresponse-associated genes in ovarian serous carcinoma[J]. Gynecol Oncol，2015，139（1）：30-39.

[7]KITAJIMA M，HATA A，YAMASHITA T，et al.Development of a reverse transcription-quantitative PCR system for detection and genotyping of aichi viruses in clinical and environmental samples[J]. Appl Environ Microbiol，2013，79（13）：3952-3958.

[8] 牟成惠，宋妙芳，鐘逸雯，等. 實時熒光雙重PCR檢測610份珠江水霍亂弧菌結果分析[J]. 實用醫(yī)學雜志，2012，28（15）：2598-2600.

[9]TAKEDA M，F(xiàn)UNATO T，IKEMOTO M，et al.Clinical usefulness of the PAXgeneTMbone marrow RNA system for stabilizing total RNA[J]. J Clin Lab Anal，2015，29（1）：61-67.

[10]張詩蒙，尹小毛，劉非，等. 基于gyrB序列Taqman實時熒光PCR檢測在MTC鑒定中的應用[J]. 實用醫(yī)學雜志，2014，30（3）：472-474.

[11]MARQUART L，BAKER M，O'ROURKE P，et al. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR[J]. Antimicrob Agents Chemother，2015，59（7）：4249-4259.

[12]程凱，余波，王建東，等. qRT-PCR檢測石蠟包埋組織microRNA的研究進展[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2014，30（11）：1273-1275.

[13]PEDERSEN K S，OKHOLM E，JOHANSEN M，et al. Clinical utility and performance of sock sampling in weaner pig diarrhoea[J]. Prev Vet Med，2015，120（3-4）：313-320.

[14]YOU Y，YAO H，YOU B，et al. Clinical significance of HAX-1 expression in laryngeal carcinoma[J]. Auris Nasus Larynx，2015，42（4）：299-304.

[15]M A S T O R A K I S，C H I M O N I D O U M，DIMITRAKOPOULOS L，et al. A rapid and accurate closed-tube methylation-sensitive high resolution melting analysis assay for the semi-quantitative determination of SOX17 promoter methylation in clinical samples[J]. Clin Chim Acta，2015，444：303-309.