黃學(xué)文， 潘 杰， 趙蘭靜， 吳 茵， 朱菊平

（華東療養(yǎng)院檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214065）

目前，在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)700多種微小RNA（microRNA，miRNA）。功能學(xué)研究結(jié)果顯示，miRNA 參與調(diào)控幾乎所有細(xì)胞生命活動(dòng)過程，在人類多種病理?xiàng)l件下均會(huì)發(fā)生表達(dá)量的變化，目前已被廣泛用于腫瘤、血液病和心血管疾病等的研究中，并可能成為疾病治療新的靶標(biāo)和無(wú)創(chuàng)性診斷新的分子標(biāo)志物[1-3]。

隨著血漿（血清）游離miRNA在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，血漿（血清）游離miRNA提取顯得越來(lái)越重要。游離miRNA在正常人的血液中含量甚微，獲得高濃度、高質(zhì)量的游離miRNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的第一步，也是關(guān)鍵的一步。本研究對(duì)目前miRNA提取常用的2種方法即柱分離方法和TRIzol提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期掌握更好、更經(jīng)濟(jì)的miRNA提取方法，為下一步實(shí)驗(yàn)提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取20名2016年10月20日來(lái)華東療養(yǎng)院體檢的志愿者作為研究對(duì)象，年齡35～55歲。全部研究對(duì)象乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物和丙型肝炎病毒血清抗體均為陰性，肝功能、腎功能、血脂和尿酸等生化指標(biāo)正常，超聲波檢查證實(shí)肝、膽、脾、胰、腎無(wú)異常，X線、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描及內(nèi)窺鏡檢查均正常。

1.2 方法

1.2.1 血漿的制備 采集所有研究對(duì)象體檢時(shí)的空腹靜脈血3 mL，加入含乙二胺四乙酸的BD抗凝管中，4 ℃ 1 900×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血漿至新的1.5 mL Eppendorf管中，然后4 ℃ 16 000×g離心10 min，吸取上清-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TRIzol法提取miRNA 取500 μL血漿，按照TRIzol試劑盒（美國(guó)Life公司）說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取并溶解于35 μL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarborate，DEPC）水中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.3 進(jìn)口硅膠吸附柱法提取miRNA 取200 μL血漿，用miRNA Neasy血清/血漿試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）按說(shuō)明書提取RNA并溶解于14 μL DEPC水中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 國(guó)產(chǎn)硅膠吸附柱法提取miRNA 取200 μL血漿，按照血漿/血清miRNA提取試劑盒（江蘇然科生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書提取RNA并溶解于14 μL DEPC水中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 提取物中β-globin基因的檢測(cè) 用TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系（日本Takara公司）檢測(cè)提取的RNA中的β-globin基因。具體步驟如下：2×PCR緩沖液12.5 μL，10 μmol/Lβ-globin基因上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/L TaqMan-BHQ1探針0.75 μL，50×ROX 0.25 μL，DEPC水0.5 μL，提取物10 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。β-globin基因的上、下游引物及TaqMan-BHQ1探針由上海英駿公司合成，序列見表1。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄 用逆轉(zhuǎn)錄體系（美國(guó)Life公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體系中包括：100 mmol/ L脫氧核糖核苷三磷酸0.15 μL、50 U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5 L、20 U/μL RNA酶抑制劑0.19 μL、10 μmol/ L miRNA-21反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物3 μL、DEPC水4.16 μL、提取物5 μL、總體積15 μL?；旌象w系放置冰上5 min，然后放入PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20 ℃保存?zhèn)溆?。miRNA-21反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物由上海英駿公司合成，序列見表1。

1.2.7 TaqMan-MGB探針檢測(cè)miRNA-21 用TaqMan-MGB探針PCR體系（江蘇昱安生物科技有限公司）進(jìn)行miRNA-21檢測(cè)。熒光定量體系中包含：反應(yīng)緩沖液4 μL，10 μmol/L miRNA-21上、下游引物各0.6 μL，10 μmol/L TaqMan-MGB探針0.4 μL，DEPC水12.15 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，50×ROX 0.25 μL，總體積20 μL。熒光定量PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。miRNA-21上、下游引物及TaqMan-MGB探針由上海英駿公司合成，序列見表1。

1.3 儀器

Heraeus Fresco 17/21冷凍微量離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），micromax微量離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），Bioer MB-102振蕩恒溫金屬浴（杭州博日公司），ABI ViiA 7DX熒光定量PCR儀（美國(guó)Life公司），ABI VERITI梯度PCR儀（美國(guó)Life公司）。

表1 引物及探針序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口硅膠吸附柱法和TRIzol法提取物中β-globin基因的檢測(cè)

國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口硅膠吸附柱法和TRIzol法提取物中β-globin基因的Ct值分別為35.487±0.356、35.591±0.332和33.529±0.499，3種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口硅膠吸附柱法β-globin基因Ct值均明顯高于TRIzol法（P＜0.000 1），而國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口硅膠吸附法β-globin基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.345 4）。

2.2 國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口硅膠吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的檢測(cè)

采用TaqMan-MGB探針qPCR 檢測(cè)miRNA-21。國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口硅膠吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的Ct值分別為26.527±0.158、26.653±0.201和28.169±0.385，3種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 3）。國(guó)產(chǎn)硅膠吸附柱法miRNA-21的Ct值低于進(jìn)口硅膠吸附柱法（P=0.033 7），國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口硅膠吸附柱法miRNA-21的Ct值均明顯低于TRIzol法（P＜0.000 1）。

3 討論

miRNA是一類長(zhǎng)約19～24 nt的非編碼單鏈小RNA 分子，在大多數(shù)真核生物中表達(dá)，參與多種生物學(xué)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，組織或血清中miRNA 的異常表達(dá)與多種人類惡性腫瘤密切相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，差異表達(dá)的miRNA可作為疾病早期診斷、分子分型及預(yù)后判斷的指標(biāo)，同時(shí)也可作為多種疾病，特別是腫瘤新的治療靶標(biāo)。目前，miRNA已成為分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-5]。

隨著血漿（血清）游離miRNA在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，血漿（血清）游離miRNA提取顯得越來(lái)越重要。目前，miRNA提取方法主要有TRIzol法和柱分離方法。TRIzol法基本沿用了mRNA 的分離技術(shù)，未考慮miRNA與mRNA在物理性質(zhì)和存在方式上的差異，如miRNA在長(zhǎng)度上遠(yuǎn)小于mRNA。此外，miRNA在細(xì)胞中主要以蛋白復(fù)合體的方式存在，因此TRIzol法容易造成miRNA大量丟失[6]。隨著材料學(xué)的發(fā)展，柱分離提取方法可在一定程度上解決上述問題，但柱提取方法成本太高，約為TRIzol法的10倍，并且多為國(guó)外公司所壟斷。近年來(lái)，隨著技術(shù)的進(jìn)步，國(guó)內(nèi)的柱分離提取方法已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。

為了篩選更好、更經(jīng)濟(jì)的miRNA提取方法，為下一步實(shí)驗(yàn)提供新的選擇，本研究采用國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口硅膠吸附柱法和TRIzol法分別提取20名志愿者血漿中的miRNA，比較3種方法提取的miRNA純度和濃度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血漿β-globin基因濃度可以代表DNA的量，因此可用TaqMan-BHQ1探針qPCR檢測(cè)提取物中的β-globin基因含量，以觀察RNA提取的純度。本研究結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口硅膠吸附柱法提取物中的β-globin基因Ct值明顯高于TRIzol法（P＜0.000 1），說(shuō)明硅膠吸附柱法提取的miRNA純度較高，并且2種硅膠吸附柱法的β-globin基因Ct值均＞35，表明這2種方法提取的miRNA中的DNA量極低，提取的miRNA純度很高。另外，國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口硅膠吸附柱法提取物中的β-globin基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明國(guó)產(chǎn)硅膠吸附柱法提取的miRNA純度也能達(dá)到進(jìn)口硅膠吸附柱法的提取純度。為了觀察提取的miRNA濃度，本研究利用反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物及TaqMan-MGB探針qPCR檢測(cè)3種方法提取物中miRNA-21的Ct值。結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口硅膠吸附柱法提取物中miRNA-21的Ct值均明顯低于TRIzol法（P＜0.000 1）。這進(jìn)一步說(shuō)明TRIzol法易造成miRNA丟失，硅膠吸附柱法能有效改善miRNA的提取效率[6]。國(guó)產(chǎn)硅膠吸附柱法miRNA-21的Ct值高于進(jìn)口硅膠吸附柱法（P=0.033 7），說(shuō)明國(guó)產(chǎn)硅膠吸附柱法提取的miRNA濃度稍高于進(jìn)口硅膠吸附柱法。

綜上所述，硅膠吸附柱法提取miRNA在提取純度和濃度上均優(yōu)于傳統(tǒng)的TRIzol法，并且國(guó)產(chǎn)硅膠吸附柱法無(wú)論在miRNA提取的純度還是濃度上均與進(jìn)口硅膠吸附柱法不相上下，完全可替代進(jìn)口硅膠吸附柱法。

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