何文婧， 高志琴， 陳 健， 任弘謹(jǐn)， 楊 虹， 蔡 晴， 楊連娟

（上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200050）

熒光染色劑Calcofluor White（CFW）能與真菌細(xì)胞壁的纖維素、幾丁質(zhì)和其他含β-1，4-糖苷鍵的碳水化合物緊密結(jié)合[1]，可吸收紫外光，使菌絲和孢子發(fā)出明亮的熒光，在熒光顯微鏡下真菌輪廓與黑暗的背景對(duì)比明顯。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室早已將熒光顯微鏡用于真菌性角膜炎等疾病病原真菌的檢測(cè)[2]，而國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室由于早年缺乏熒光顯微鏡，一直沿用KOH濕片鏡檢法加真菌培養(yǎng)法來(lái)檢測(cè)真菌。但真菌培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，傳統(tǒng)KOH濕片鏡檢法假陽(yáng)性率高，使這2種方法均不能滿足臨床需要。本研究對(duì)疑似真菌感染患者的臨床樣本同時(shí)進(jìn)行了KOH濕片鏡檢法、CFW熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢測(cè)，以評(píng)價(jià)CFW熒光染色法檢測(cè)疑似真菌感染的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取上海市皮膚病醫(yī)院門(mén)診疑似真菌感染患者共155例，其中男79例、女76例，年齡（42.0±17.6）歲。采集腹股溝、指（趾）甲、頭、手、足、胸、龜頭包皮等部位的樣本和白帶等。每例樣本分別采用KOH濕片鏡檢法、CFW熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢測(cè)。在進(jìn)行真菌培養(yǎng)時(shí)，每例樣本接種于2管沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA）上，26 ℃培養(yǎng)2～3周。

1.2 試劑

熒光染色劑CFW購(gòu)自石家莊博洋生物科技有限公司（批號(hào)20160613）。溶液A主要由熒光增白劑、氫氧化鉀和水組成，高濃度的熒光素與真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)相結(jié)合，標(biāo)記熒光。溶液B為復(fù)染劑，由伊文思藍(lán)和水組成，復(fù)染劑可降低樣本組織的背景亮度，增加對(duì)比度，使熒光信號(hào)更加清晰。10%/20%KOH溶液由KOH和水配制而成。指（趾）甲或角質(zhì)層較厚的皮屑用20%KOH溶液溶解，其他樣本用10%KOH溶液溶解。KOH能溶解臨床樣本中的角質(zhì)，使組織透明。

1.3 方法

采集每例患者3份適量樣本，分別用于KOH濕片鏡檢法、CFW熒光染色法、真菌培養(yǎng)法檢測(cè)。

1.3.1 KOH濕片鏡檢法 取適量臨床樣本置于載玻片上，加1滴KOH溶液，蓋上蓋玻片。放置片刻或在酒精燈火焰上微加熱，即在酒精燈火焰上快速通過(guò)2～3次，不應(yīng)使其沸騰，以免結(jié)晶，然后輕壓蓋玻片，驅(qū)逐氣泡、壓薄樣本。先在低倍鏡下檢查有無(wú)菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)、特征、位置、大小和排列方式等。

1.3.2 CFW熒光染色法 將載有臨床樣本的載玻片放置在水平操作臺(tái)上，直接向樣本上滴加1滴溶液A，靜置1 min，如樣本的角質(zhì)化程度較高，需靜置2 min，可適當(dāng)加熱，以不沸騰為度。 滴加溶液B 1滴，靜置1 min。 蓋上蓋玻片，輕輕壓蓋玻片，用棉簽吸去多余的染色劑。將樣本置于CX23熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察：先用低倍鏡找到樣本所在位置，再用高倍鏡尋找菌絲或孢子等結(jié)構(gòu)加以證實(shí)。

1.3.3 真菌培養(yǎng)與鑒定 將臨床樣本分別接種于含有50 μg/mL氯霉素的SDA和含有500 μg/mL放線菌酮的SDA上，置26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3周。絲狀真菌通過(guò)菌落特征和顯微鏡下特征鑒定，念珠菌通過(guò)轉(zhuǎn)種科馬嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基或用API20CAUX測(cè)試板條鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較CFW熒光染色法與KOH濕片鏡檢法的檢測(cè)結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種方式對(duì)不同疾病患者樣本的檢測(cè)結(jié)果

155例患者不同部位樣本的真菌檢測(cè)結(jié)果顯示，CFW熒光染色法陽(yáng)性率（85.8%）最高，KOH濕片鏡檢法陽(yáng)性率（76.1%）次之，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.45，P＜0.05）。真菌培養(yǎng)法陽(yáng)性率（71.0%）最低。其中，脂溢性皮炎、生殖器念珠菌病、馬拉色菌性毛囊炎等患者的皮屑在鏡下可見(jiàn)少量或大量孢子，CFW熒光染色法對(duì)孢子鏡檢的陽(yáng)性率明顯高于KOH濕片鏡檢法；對(duì)于手足癬、體股癬和頭癬患者，CFW熒光染色法與KOH濕片鏡檢法陽(yáng)性率相當(dāng)；CFW熒光染色法對(duì)甲真菌病患者檢測(cè)的陽(yáng)性率（100.0%）稍高于KOH濕片鏡檢法（89.5%）。見(jiàn)表1。

表1 不同疾病患者3種方法的真菌檢測(cè)結(jié)果[例（%）]

2.2 不同菌種CFW熒光染色法與KOH濕片鏡檢法陽(yáng)性率比較

對(duì)155例患者皮屑進(jìn)行真菌培養(yǎng)，其中107例真菌培養(yǎng)陽(yáng)性并做真菌菌種鑒定。對(duì)比不同菌種KOH濕片鏡檢法與CFW熒光染色法的陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)2種方法檢測(cè)皮膚癬菌與非皮膚癬菌真菌的陽(yáng)性率差異不大，而CFW熒光染色法對(duì)酵母的陽(yáng)性率明顯高于KOH濕片鏡檢法。見(jiàn)表2。

2.3 不同感染部位樣本的熒光染色鏡下形態(tài)

不同感染部位樣本的熒光染色鏡下形態(tài)見(jiàn)圖1～6。

圖1 甲癬熒光染色鏡下形態(tài)

圖2 花斑糠疹熒光染色鏡下形態(tài)

圖3 足癬熒光染色鏡下形態(tài)

圖4 毛囊炎熒光染色鏡下形態(tài)

圖5 頭癬熒光染色鏡下形態(tài)

圖6 毛囊蟲(chóng)熒光染色鏡下形態(tài)

3 討論

淺部真菌感染的診斷主要依賴(lài)于臨床樣本的真菌直接鏡檢和培養(yǎng)[3]。在傳統(tǒng)真菌感染的診斷中，KOH濕片鏡檢法是最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的方法，但該法的準(zhǔn)確檢測(cè)需要有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)工作者，降低把細(xì)胞壁、纖維誤認(rèn)為菌絲[4-5]，把氣泡和油滴誤認(rèn)為孢子的概率才能實(shí)現(xiàn)。真菌培養(yǎng)結(jié)果與皮屑采集的質(zhì)量、數(shù)量及患者的近期用藥情況均息息相關(guān)，且耗時(shí)長(zhǎng)。在本研究中，真菌培養(yǎng)法在真菌性疾病的診斷中陽(yáng)性率最低。真菌熒光染色劑CFW為二苯乙烯類(lèi)化合物，是一種非特異性熒光染料，能夠非特異性地結(jié)合β-1，3-糖苷鍵和β-1，4-糖苷鍵連接的多糖，如幾丁質(zhì)、葡萄糖、纖維素。在熒光顯微鏡下，發(fā)散光和激發(fā)光波長(zhǎng)在355 nm時(shí)，真菌發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，而其他成分呈微弱的灰藍(lán)色，是能快速檢測(cè)真菌的新型染色劑，適用于各種疑似真菌感染的檢查，如體股癬、手足癬、頭癬、甲癬和花斑糠疹等，也可與各類(lèi)真菌結(jié)合而發(fā)出熒光，包括毛癬菌、念珠菌、馬拉色菌及曲霉等。本研究在CFW熒光染色法真菌鏡檢過(guò)程中偶見(jiàn)明顯的毛囊蟲(chóng)蟲(chóng)體（圖6），與周?chē)尘靶纬甚r明對(duì)此，蟲(chóng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，由此可見(jiàn)CFW熒光染色法也可用于臨床毛囊蟲(chóng)的檢查。

KOH溶液使真菌在組織皮屑中更明顯，熒光染色劑因結(jié)合真菌細(xì)胞壁的多糖等成分而使真菌檢測(cè)更具敏感性和特異性[6-7]，尤其在酵母感染性真菌病的診斷中效果更好。RAMOS等[8]的研究表明馬拉色菌分離培養(yǎng)非常困難和低效，但CFW熒光染色法為馬拉色菌病提供了一種快速、有效的早期診斷方法。BHAVASAR等[9]研究顯示，在眾多念珠菌檢測(cè)方法中CFW熒光染色法更具可靠性和敏感性。

以往的文獻(xiàn)已證實(shí)熒光染色法在真菌檢測(cè)中較傳統(tǒng)的KOH濕片鏡檢法具有敏感性強(qiáng)、陽(yáng)性率高的優(yōu)點(diǎn)[10-12]。CFW熒光染色法檢測(cè)淺部真菌病快速、有效、簡(jiǎn)便，值得在臨床推廣應(yīng)用。臨床上也可同時(shí)結(jié)合KOH濕片鏡檢法和真菌培養(yǎng)法，使真菌檢測(cè)結(jié)果更加直觀和準(zhǔn)確。

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