龐克堅 翟 欣 唐 輝* 羅 蘭 王亞喬

(1.和田維吾爾藥業(yè)股份有限公司，新疆 和田 848200； 2.石河子大學藥學院，新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002)

西紅花苷是名貴中藥西紅花的有效成分，具有抗血小板聚集，保護血管內皮細胞，改善心肌缺血，調血脂等多種作用[1-7]，其中2個主要成分西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ亦是目前西紅花質量控制的指標成分。

羅補甫克比日丸是新疆維吾爾族特色藥之一，主要由丁香、西紅花、花椒、胡蘿卜子、肉桂、韭菜子等30 味藥材組成，具有溫補腦腎、益心填精的功效，主要用于陽痿、抑郁、早泄、滑精、體虛、消瘦、神經衰弱的治療，屬部頒標準維吾爾藥分冊收錄品種[8]。部頒標準僅采用理化鑒別試驗來控制該制劑的質量，并未對貴細藥材西紅花進行質量控制。制劑中西紅花的質量與藥品療效密切相關，應予以關注。為進一步完善羅補甫克比日丸質量標準，本實驗對羅補甫克比日丸的西紅花藥材和制劑中的西紅花苷含量進行測定，對全面客觀地評價羅補甫克比日丸藥品質量提供科學依據。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters Acquity超高效液相色譜儀(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器、Empower 色譜工作站)，KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(BT125D，德國賽多利斯公司)。

1.2 試藥 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ(批號：111588-201303、111589-201304中國食品藥品檢定研究院)，西紅花藥材(201611)、羅補甫克比日丸(批號：20170204、20170301、20170302) 由和田維吾爾藥業(yè)有限責任公司生產；乙腈為色譜純；水為雙蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ色譜條件 采用 Waters HSS-C18 (100mm×2.1mm，1.8μm) 色譜柱，流動相:以乙腈(A)-水溶液(B) 為流動相，梯度洗脫(0～5 min，20% →40% A；5～5.5min，40%→20%A，5.5～6min，20% →20% A)，流速0.2 mL/min，檢測波長：440nm，柱溫為35 ℃，對照品進樣體積1μL，西紅花藥材及供試品進樣體積5μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ對照品適量，分別加50%乙醇溶解，制成濃度分別為 0.543 mg/mL、0.603 mg/mL的對照品溶液。各取對照品溶液適量，加50%乙醇定容至5 mL容量瓶，制得西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ混合對照品濃度分別為54.30 μg/mL、60.30 μg/mL的混合對照品溶液。避光保存在4℃下備用。

2.2.2 西紅花藥材溶液的配制 取西紅花藥材約0.5 g，精密稱定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超聲(功率500 W，頻率50 kHz)30 min，放至室溫，用50%乙醇補足至刻度，過濾，濾液經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液的配制 取羅補甫克比日丸1.5 g，精密稱定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超聲(功率500 W，頻率50 kHz)30 min，放至室溫，用50%乙醇補足至刻度，過濾，濾液經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密量取“2.2”項下對照品溶液、西紅花藥材溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度>1.5；理論板數(shù)以西紅花苷-Ⅰ峰計不少于5000，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ保留時間分別為 4.683、5.463 min 。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ線性關系考察 取“2.2.1”項下的混合對照品在“2.1”項色譜條件下分別取0.3、0.6、1.2、2.4、4.8和7.5 μL進樣測定。以峰面積 Y 為縱坐標，進樣量X (μg)為橫坐標進行線性回歸，結果見表1。

表1 線性關系考察結果 (n=6)

2.5 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ精密度試驗 取同一混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD分別為0.61%、0.54%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ重復性試驗 取同一樣品羅補甫克比日丸供試品溶液6份，每份1.5 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下進行分析，記錄各色譜峰面積，結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD分別為1.6% 和0.99%，結果表明方法重復性良好。

2.7 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ穩(wěn)定性試驗 將制備的羅補甫克比日丸供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h內進樣6次，記錄峰面積，結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ12 h內的峰面積的RSD分別為1.5和1.3%。

2.8 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ加樣回收率實驗 取已測知西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ2種成分準確含量的羅補甫克比日丸9份，每份約0.5 g，精密稱定，再分別精密加入相當于含量80%、100%、120%的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ對照品溶液，按“2.2.3”項方法分別制備得到低、中、高不同濃度的供試溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率和RSD值，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ平均加樣回收率( n=9) 分別為99.90%和100.1%，RSD 分別為1.6%和1.3%。結果表明該方法的加樣回收率良好。結果見表2。

表2 加樣回收率實驗結果(n=9)

3 含量測定

3.1 西紅花藥材含量測定 取西紅花藥材平行3份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，計算羅補甫克比日丸中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的含量，結果見表3。

由結果表明，西紅花中西紅花苷的總量符合標準要求[9](>10%)。

表3 西紅花藥材含量測定實驗結果(mg/g n=3)

3.2 羅補甫克比日丸制劑含量測定 取3批樣品，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，計算羅補甫克比日丸中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的含量，結果見表4。

由結果表明，3份樣品西紅花苷含量相對較穩(wěn)定。

表4 樣品含量測定實驗結果(μg/丸 n=3)

4 討論

4.1 檢測波長的選擇 取西紅花苷對照品儲備液(0.543 mg/mL、0.603 mg/mL)適量，用50%乙醇溶解并稀釋成18.10 μg/mL、20.10 μg/mL溶液，用紫外可見分光光度計于 200～600nm 處進行掃描，從其紫外圖譜中可見其在440nm 處有最大吸收，與有關參考文獻[10]報道的440 nm 一致，故選擇440 nm 為檢測波長。

4.2 提取溶劑的選擇 分別比較甲醇、50% 甲醇、乙醇、50%乙醇的提取效率，結果顯示50%乙醇提取效率最高，因此最終選擇50%乙醇作為提取溶劑。

4.3 流動相的選擇 在選擇流動相時，我們首先參照2015版中國藥典的色譜條件，甲醇-水(45:55)為流動相，但此條件下西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ出峰峰形不理想，分離度較差。在綜合了有關文獻報道[10-14]的基礎上，經過多次摸索，最終擬定了乙腈和水為流動相進行梯度洗脫，所得峰形良好，分離度高。

5 結論

通過測定西紅花藥材中西紅花苷的含量，表明，企業(yè)在制劑生產中的藥材質量是有保證的。測定的羅補甫克比日丸中西紅花苷的含量也符合企業(yè)標準。

本實驗所建立的超高效液相色譜分析方法與條件能較好地測定西紅花和羅補甫克比日丸中西紅花苷的含量。本實驗方法精密度、重復性和穩(wěn)定性良好，結果穩(wěn)定可靠，并且采用的超高效液相色譜法相較高效液相色譜方法靈敏度高、分析時間短。能夠為建立更加科學規(guī)范的羅補甫克比日丸質量評價和控制方法提供參考。

[1]馬世平, 劉保林, 周素娣, 等. 西紅花總苷的藥理學研究Ⅱ對血凝、血小板聚集及血栓形成的影響[J]. 中草藥, 1999, 3(3): 196.

[2]THUSHARARM, HEMSHEKHAR M, SANTHOSH MS, et al. Crocin, a dietary additive protects platelets from oxidative stress-induced apoptosis and inhibits platelet aggregation[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 373(1-2): 77.

[3]何書英, 錢之玉. 西紅花苷對氧化性低密度脂蛋白致內皮細胞損傷的保護作用[J]. 中國新藥雜志, 2005, 14(2): 169.

[4]緒廣林, 錢之玉. 西紅花苷對血管內皮細胞的保護作用研究[J]. 中草藥, 2002, 33(5): 439.

[5]杜鵬, 錢之玉, 沈祥春, 等. 西紅花苷對大鼠心肌損傷的影響[J]. 中國新藥雜志, 2005, 14(12): 1423.

[6]錢之玉. 西紅花苷調血脂作用的實驗和臨床研究[J]. 中國執(zhí)業(yè)藥師, 2009, 6(2): 6.

[7]緒廣林, 余書勤, 龔祝南, 等. 西紅花苷對大鼠實驗性高脂血癥的影響及其機制研究[J].中國中藥雜志, 2005, 30(5): 369.

[8]中國藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準(維吾爾藥分冊)[M]. 烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社, 1998: 155.

[9]國家藥典委員會.中國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:129-130.

[10]李順旭, 楊大堅, 李榮東, 等. 高效液相色譜梯度洗脫法測定不同中國產西紅花藥材中西紅花苷Ⅰ、Ⅱ的含量[J]. 中南藥學,2010,(12): 886-889.

[11] 張留記, 劉欽松, 屠萬倩, 等. RP-HPLC法同時測定不同產地梔子中梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量[J]. 中國藥房, 2011, 3(07):630-632.

[12] 梁華正, 丁武輝, 袁東香, 等. 梔子中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的高效液相色譜法測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2012, 5(10): 2386-2388.

[13] 馬慧萍, 李蘭茹, 董志臣, 等. HPLC法測定紅花益氣養(yǎng)血膠囊中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量[J]. 解放軍藥學學報, 2013, 7(06): 512-514.

[14] 李木子,王京輝,蔡程科,等. 梔子飲片質量分析研究[J]. 藥物分析雜志,2014,(06):1025-1032.