董文竹 王政 文舒安 張婷婷 霍鳳敏 董玲玲 李云絮 趙立平 黃海榮 高飛 逄宇

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的慢性傳染病，主要的治療方法是依靠抗結(jié)核藥物進(jìn)行規(guī)范的化療。但是常用的抗結(jié)核藥物異煙肼(INH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)等已經(jīng)越來(lái)越多地被結(jié)核分枝桿菌所耐受。世界衛(wèi)生組織(WHO)2017年全球結(jié)核病報(bào)告估算全球新發(fā)耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者約為49萬(wàn)例，其中，MDR-TB疫情最嚴(yán)重地區(qū)是印度、中國(guó)及俄羅斯；而其中約有5.6%的患者為廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)。治療MDR-TB及XDR-TB的一個(gè)重要途徑就是研發(fā)新的治療藥物。SQ109作為乙胺丁醇(EMB)類似物中篩選出的抗結(jié)核新藥，在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出與INH和RFP具有協(xié)同作用，并且未見(jiàn)對(duì)其他抗結(jié)核藥物的拮抗作用[1]，但是其對(duì)MDR-MTB及XDR-MTB臨床分離菌株的抑菌效果在我國(guó)缺乏進(jìn)一步研究。因此，筆者選取MDR-MTB及XDR-MTB臨床分離株，以微孔板阿爾瑪藍(lán)顯色法(micro-plate alamar blue assay，MABA)檢測(cè)菌株對(duì)于SQ109的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)，探究SQ109的體外抑菌效果。

材料和方法

1.菌株：收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院2014年7月至2016年12月臨床分離培養(yǎng)陽(yáng)性的MTB菌株。根據(jù)WHO建議，將對(duì)INH及RFP同時(shí)耐藥的109株菌株作為MDR菌株；將對(duì)INH及RFP同時(shí)耐藥，對(duì)氧氟沙星耐藥且對(duì)于阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素中的至少1種耐藥的114株菌株作為XDR菌株，兩種菌株共計(jì)223株。本研究中所有耐藥菌株均在國(guó)家結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，且通過(guò)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)進(jìn)行抑制生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

2.試劑儀器：藥敏試驗(yàn)所用SQ109、7H9培養(yǎng)基藥粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；中性羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自珠海銀科公司；營(yíng)養(yǎng)添加劑OADC購(gòu)自美國(guó)BD公司；96孔板購(gòu)自美國(guó)Coster公司；阿爾瑪藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

3.MABA藥敏試驗(yàn)：SQ109的藥物終濃度為0.016～16.000 mg/L。將SQ109溶解后，用最高濃度進(jìn)行2倍梯度稀釋，制成含藥的96孔板。將選取的菌株接種在中性羅氏培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周，刮取新鮮菌落，用磨菌瓶研磨均勻。將菌液稀釋至1麥?zhǔn)蠁挝缓笤俅蜗♂?/20，加入預(yù)先加入藥物的96孔板中，每孔100 μl。每株菌株設(shè)立1個(gè)不含藥物的陽(yáng)性對(duì)照孔。加入菌液后37 ℃培養(yǎng)7 d，每孔加入由20 μl 阿爾瑪藍(lán)和50 μl 5% Tween-80預(yù)混好的顯色液，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行結(jié)果判讀。判斷標(biāo)準(zhǔn)是孔內(nèi)液體呈紅色為有菌生長(zhǎng)，呈藍(lán)色則無(wú)菌生長(zhǎng)，以最后一個(gè)藍(lán)色孔的藥物濃度作為MIC值。按照以MIC值為橫坐標(biāo)，菌株數(shù)或菌株所占百分比為縱坐標(biāo)做圖，如果呈單峰態(tài)分布，流行病學(xué)界值(ECOFF值)被定義為能抑制99.9%的細(xì)菌群的濃度；對(duì)于雙峰態(tài)分布，ECOFF值則在2個(gè)峰值中間[2]。

4.菌株DNA提取：采用煮沸法粗提細(xì)菌DNA。刮取一環(huán)新鮮菌落到500 μl 三羥甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)(TE)緩沖液中，金屬浴加熱煮沸30 min以裂解細(xì)菌。然后，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心5 min，取含有細(xì)菌DNA的上清液放入新的1.5 ml離心管中，作為PCR的DNA模板使用。

圖1 223株XDR和MDR臨床分離菌株對(duì)SQ109的MIC值頻數(shù)分布情況

5.北京基因型與非北京基因型菌株的分離：采用RD207基因作為北京基因型和非北京基因型的分離標(biāo)準(zhǔn)，即缺乏RD207基因者為北京基因型，含有RD207基因者為非北京基因型。RD207引物序列為：P1：CATGCGGCGATCTCATTGTT；P2：GCACTGTTACCCGCACTTTC。50 μl的PCR體系按照25 μl 2×PCR混合物，5 μl的DNA模板，各0.2 μl的上下游引物。PCR的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用前述方法進(jìn)行判讀。

6.EMB耐藥及敏感菌株的耐藥率比較：采用臨床羅氏培養(yǎng)及液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果中的EMB耐藥情況作為菌株分離標(biāo)準(zhǔn)，將菌株分為EMB耐藥菌株和EMB敏感菌株，比較兩者對(duì)SQ109耐藥率的差異。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算MDR及XDR菌株、北京基因型及非北京基因型菌株、EMB敏感及耐藥菌株對(duì)SQ109的耐藥率；不同特征菌株耐藥率的比較，以及北京基因型和非北京基因型菌株在不同MIC值分布差異的比較均采用Fisher精確概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. MIC值檢測(cè)結(jié)果：223株XDR和MDR菌株的MIC值分布在<0.016～16.000 mg/L之間，主要集中在0.120 mg/L(38.1%，85/223)及0.250 mg/L(43.0%，96/223)。根據(jù)菌株對(duì)SQ109的MIC值頻數(shù)分布情況，確定ECOFF值為1.000 mg/L(圖1)。對(duì)SQ109總耐藥菌株數(shù)為5株，總耐藥率為2.2%(5/223)。其MIC值分別為4.000 mg/L(1/5)、8.000 mg/L(3/5)、16.000 mg/L(1/5)。XDR菌株中有5株對(duì)SQ109耐藥，耐藥率為4.4%(5/114)；MDR菌株中無(wú)耐藥菌株，耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率法，P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.不同基因型分離結(jié)果：109株MDR菌株中共分離出8株非北京基因型菌株，114株XDR菌株中共分離出10株非北京基因型菌株。205株北京基因型菌株MIC值范圍為<0.016～16.000 mg/L，主要集中在0.120 mg/L(39.0%，80/205)和0.250 mg/L(43.9%，90/205)；對(duì)SQ109耐藥菌株數(shù)為5株，耐藥率為2.4%。非北京基因型菌株的MIC值范圍為0.030～0.500 mg/L，主要集中在0.120 mg/L(27.8%，5/18)和0.250 mg/L(33.3%，6/18)；未發(fā)現(xiàn)對(duì)SQ109耐藥菌株。經(jīng)比較，北京基因型和非北京基因型菌株耐藥率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率法，P>0.05)，見(jiàn)表2。

3.EMB敏感及耐藥菌株MIC值分布：223株菌株中共有138株EMB敏感菌株和85株EMB耐藥菌株。EMB敏感菌株的MIC值范圍為<0.016～8.000 mg/L，主要集中在0.120 mg/L(36.2%，50/138)和0.250 mg/L(46.4%，64/138)；對(duì)SQ109耐藥菌株為1株，其MIC值為8.000 mg/L，耐藥率為0.7%(1/138)。EMB耐藥菌株的MIC值范圍為0.016～16.000 mg/L，主要分布于0.120 mg/L(41.2%，35/85)和0.250 mg/L(37.6%，32/85)；對(duì)SQ109耐藥菌株為4株，耐藥率為4.7%(4/85)。經(jīng)比較，EMB敏感和耐藥菌株對(duì)SQ109耐藥率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率法，P>0.05)，見(jiàn)表3。

討 論

MDR-MTB及XDR-MTB感染已成為全世界結(jié)核病治療的難題。為解決這個(gè)難題，新藥的研發(fā)成為關(guān)注的焦點(diǎn)。SQ109是從EMB類似物中篩選出來(lái)的具有潛力的新藥。該藥具有腸道吸收效果好，以及與INH、RFP具有協(xié)同作用，并與其他一線抗結(jié)核藥物無(wú)拮抗作用的優(yōu)點(diǎn)。研究顯示，SQ109與RFP聯(lián)合使用時(shí)，在極低濃度下可對(duì)超過(guò)99%的MTB具有生長(zhǎng)抑制作用，且對(duì)耐RFP的菌株均有效[1]。這使得SQ109對(duì)MDR-MTB及XDR-MTB具有較強(qiáng)的抑菌作用。SQ109的Ⅰ期臨床研究顯示，其在人體內(nèi)無(wú)論是單一劑量還是多劑量使用時(shí)均具有良好的安全性及耐受性；而Ⅱ期臨床研究表明，SQ109單一療法每日劑量為75、150和300 mg或和標(biāo)準(zhǔn)劑量的RFP聯(lián)合使用時(shí)也表現(xiàn)出良好的安全性及耐受性[3-4]。

在本次研究中，XDR菌株對(duì)于SQ109的耐藥率為4.4%，低于同類試驗(yàn)中的環(huán)絲氨酸(22.4%)、利奈唑胺(5.6%)、氯法齊明(5.6%)，與德拉馬尼(4.4%)、貝達(dá)喹啉(3.3%)結(jié)果相當(dāng)[5-6]。顯示出SQ109對(duì)XDR菌株生長(zhǎng)抑制作用較好。這對(duì)于目前幾乎“無(wú)藥可治”的XDR-TB具有重要意義。而本次實(shí)驗(yàn)中，MDR菌株對(duì)SQ109的耐藥率和XDR菌株相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能由于樣本量較少所致，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

ECOFF值是通過(guò)藥物MIC值估計(jì)的藥物最佳抑菌濃度，也就是當(dāng)藥物濃度達(dá)到ECOFF值時(shí)，能夠抑制大部分細(xì)菌生長(zhǎng)。本次研究通過(guò)MIC值確定的ECOFF值為1.000 mg/L，即當(dāng)藥物濃度為1.000 mg/L時(shí)，可以有效抑制98.2%的菌株的生長(zhǎng)，與國(guó)外同類研究結(jié)果相符[7]。而既往研究顯示，對(duì)MTB感染小鼠每天口服25 mg/kg的SQ109處理后，其血藥濃度峰值為0.135 mg/L。而通過(guò)檢測(cè)口服藥物的小鼠組織中的SQ109水平，發(fā)現(xiàn)肺部藥物濃度最高，其次為脾臟，肺部藥物濃度至少可以達(dá)到其MIC值的10倍水平，在用藥期間可以達(dá)到其血藥濃度的120倍，可以有效抑制MTB生長(zhǎng)；而心臟、腦、血漿中藥物濃度較低[8-9]。所以，這個(gè)有效藥物濃度在小鼠實(shí)驗(yàn)中的肺和脾臟中是可以達(dá)到的，但是在血漿、心臟、腦等組織中難以達(dá)到，也就是說(shuō)SQ109可能對(duì)于肺結(jié)核的效果優(yōu)于心包結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎等肺外結(jié)核。而目前在小鼠實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了SQ109在停止給藥后藥效仍能延續(xù)10～15 d[10]。這對(duì)于降低藥物口服頻率，簡(jiǎn)化治療方案較為有利。但是，目前缺乏SQ109在人體中藥物濃度的研究數(shù)據(jù)，所以此ECOFF值還需要根據(jù)人體血藥濃度及組織中藥物濃度進(jìn)行驗(yàn)證。

在223株XDR及MDR結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群臨床分離菌株中，實(shí)驗(yàn)分離出205株北京基因型菌株。研究發(fā)現(xiàn)，在俄羅斯、越南、伊朗、愛(ài)沙尼亞、美國(guó)紐約等地區(qū)，北京基因型菌株與對(duì)藥物的耐藥率間存在明顯相關(guān)性，但是在印度尼西亞、阿塞拜疆、哥倫比亞等地區(qū)，北京基因型菌株和非北京基因型菌株在耐藥率方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5]；中國(guó)香港地區(qū)北京基因型分離株的耐藥率低于非北京基因分離株[5]。說(shuō)明北京基因型菌株和耐藥率相關(guān)情況可能具有地區(qū)差異性。在對(duì)環(huán)絲氨酸、對(duì)氨基水楊酸藥物的研究中顯示，北京基因型和非北京基因型菌株耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5]；但是在對(duì)RFP研究中顯示，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]，說(shuō)明北京基因型菌株和耐藥率的相關(guān)情況也可能受到藥物類型及使用情況的影響。本次研究顯示SQ109的耐藥情況可能與北京基因型無(wú)關(guān)。但是，本次研究中非北京基因型菌株僅為18株，樣本量較少，因此，有待擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步研究。SQ109作為EMB的類似物，是否和EMB形成交叉耐藥也是臨床用藥的一個(gè)考慮要點(diǎn)。本次研究中，通過(guò)對(duì)MDR和XDR菌株中EMB敏感菌株和耐藥菌株的分離對(duì)比發(fā)現(xiàn)，EMB敏感和耐藥的菌株對(duì)SQ109的耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

最后，本研究?jī)H對(duì)SQ109的體外抑菌情況進(jìn)行了分析討論，在研究中出現(xiàn)的5株SQ109耐藥菌株的耐藥機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步做試驗(yàn)驗(yàn)證。

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