冉飛勇 付雷 王彬 郭少晨 陸宇 陳效友

結(jié)核病是全世界的第九大死因，在傳染性疾病中排名第一。根據(jù)WHO 2017年報告，2016年全球范圍內(nèi)估計有1040萬例結(jié)核病新發(fā)患者，死亡約170萬例；我國結(jié)核病新發(fā)患者89.5萬例，死亡6.8萬例，結(jié)核病在全球及我國疫情形勢依然嚴峻[1]。

結(jié)核病化學(xué)治療面臨著療程長，不良反應(yīng)多，患者依從性差，導(dǎo)致諸多患者，尤其是復(fù)治和耐藥結(jié)核病患者療效不確切。由于抗結(jié)核新藥開發(fā)困難，近40年來僅有貝達喹啉和德拉馬尼兩種新藥上市[2-5]，耐藥結(jié)核病患者的化學(xué)治療受到嚴峻挑戰(zhàn)。因而，開發(fā)一些輔助結(jié)核病治療措施，在提高療效、縮短痰菌陰轉(zhuǎn)時間及(或)縮短療程方面顯得尤為急切。維生素D是結(jié)核病免疫輔助治療的代表藥物之一，在抗生素出現(xiàn)之前，高劑量的維生素D被用來治療肺結(jié)核并取得了較好的效果[6]。然而，維生素D輔助治療結(jié)核病的療效報道結(jié)果不盡一致[7-11]。為此，筆者建立豚鼠結(jié)核病動物模型，評價每日給予常規(guī)劑量維生素D和單次高劑量維生素D隔周給藥兩種方式輔助治療豚鼠結(jié)核病的效果，探討維生素D在結(jié)核病治療中的價值。

材料和方法

一、材料

1.菌株：結(jié)核分枝桿菌標準株(H37Rv， ATCC27294)為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院耐藥結(jié)核病研究北京市重點實驗室保存。

2.實驗動物：無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級4～6周齡豚鼠(Hartley品系)56只，雌雄各半，體質(zhì)量為300～350 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供；實驗動物使用許可證號：SCXK(京)20160011。飼養(yǎng)條件：室溫為(21±2) ℃，濕度為(55±15) %，可自由進食水的負壓感染動物房。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院動物倫理委員會批準。

3.實驗藥物：實驗級維生素D3原(批號G131861)，購于德國Dr.Ehrenstorfer 有限責(zé)任公司；異煙肼標準品(批號MKBZ8025V)、利福平標準品(批號WXBC3355V)均購于美國Sigma公司。

4.試劑：1×PBS(磷酸鹽緩沖液)，Tween80(批號2016-06-01)購于無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；實驗級花生油(批號1F6E770)，購于瑞典化學(xué)(上海)技術(shù)有限公司； OADC(oleic acid-albumin-dextrose-catalase； 油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶)增菌液(批號7082603)，購于美國BD公司。

5．儀器：氣溶膠感染裝置(型號：099CA4224)，購于美國Glas-Col公司；霧化器、勻漿機(型號：PRO200)均購于美國PRO Scientific公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(型號MU5810E),購于美國MUAIRE公司；酶標儀(型號：BioTek Synergy2)，購于美國BioTek儀器有限公司。

二、方法

1.感染用菌液的制備：用1×PBS+0.04%Tween 80稀釋H37Rv標準株凍存液(濃度為4×108CFU/ml)至感染濃度5×105CFU/ml，終體積為40 ml。取0.1 ml稀釋的菌懸液接種于7H11培養(yǎng)基上，在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育3周，觀察結(jié)核分枝桿菌菌落生長情況，計算活菌數(shù)及其對數(shù)值(lgCFU)。

2.建立豚鼠慢性結(jié)核病模型:按照氣溶膠感染裝置操作程序，雌雄各28只豚鼠分批進行。將待感染豚鼠放入感染裝置，關(guān)閉腔室，吸取10 ml菌懸液(5×105CFU/ml)加入霧化器，按照預(yù)熱15 min、霧化30 min、煙霧衰減30 min、凈化15 min等步驟進行霧化感染和殺菌消毒。感染后豚鼠分籠飼養(yǎng)于負壓感染動物房內(nèi)，感染10 d后隨機抓取4只(雌雄各半)用于驗證感染是否成功，感染28 d隨機抓取4只(雌雄各半)作為實驗基線。

3.實驗分組及給藥方式：將氣溶膠方式感染后的48只豚鼠隨機分為6組，分別是空白對照組，每日常規(guī)劑量維生素D組(VD組)，單次高劑量維生素D隔周給藥組(VDH組)，異煙肼-利福平化療組(H-R組)，異煙肼-利福平化療聯(lián)合每日常規(guī)劑量維生素D給藥組(H-R+VD組)，異煙肼-利福平化療聯(lián)合單次高劑量維生素D隔周給藥組(H-R+VDH組)，每組8只，雌雄各半；均灌胃給藥，采用1.6 mm×80 mm彎頭灌胃針進行灌胃給藥，每天記錄有無不良反應(yīng)發(fā)生。

4.給藥劑量和頻次：依據(jù)文獻[7，12]，本研究設(shè)定了2種補充維生素D的方式：每日常規(guī)劑量(10 000 IU， 1次/d)和單次高劑量(100 000 IU，隔周1次)。根據(jù)人體和豚鼠等效劑量公式換算為豚鼠給藥劑量，按照每日常規(guī)劑量(775 IU/kg，1次/d)和單次高劑量(7750 IU/kg，隔周1次)2種方式給藥。由于豚鼠生長快，需每周稱取豚鼠體質(zhì)量，計算給藥量，配制藥物。異煙肼和利福平分別用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液，給藥終體積為0.1 ml；維生素D3原溶于實驗級花生油，給藥終體積為0.1 ml。采用溶劑對照方法設(shè)置分組和給藥，見表1。

5.觀察豚鼠生長情況：給藥同時觀察豚鼠生長情況，每周稱取豚鼠體質(zhì)量。

6.豚鼠解剖和臟器稱質(zhì)量：給藥4周和8周后每組取4只豚鼠(雌雄各半)，稱取豚鼠體質(zhì)量，采用空氣栓塞法處死豚鼠并解剖，留取肺臟和脾臟標本，觀察臟器病變并稱質(zhì)量。

7.活菌計數(shù)：每只豚鼠1/2(左半)肺臟加入含10 ml生理鹽水的勻漿管中，用勻漿機(10 000 r/min)勻漿，取1/2(左半)脾臟加入含5 ml生理鹽水的勻漿管中，用勻漿機勻漿(10 000 r/min)。根據(jù)病變程度接種不同的稀釋度，10倍系列4個梯度稀釋，每個稀釋度取0.1 ml接種于7H11培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，3 周后進行菌落計數(shù)，并計算每只豚鼠肺臟和脾臟的活菌數(shù)，以對數(shù)形式表示。

8.組織病理學(xué)檢查：取實驗中各組豚鼠1/2(右半)肺臟、脾臟固定于10%福爾馬林水溶液中，石蠟包埋切片，蘇木精/伊紅染色后，高倍鏡下觀察各組織的病理改變。根據(jù)結(jié)核特異性改變從病變范圍、原發(fā)損傷、繼發(fā)損傷、壞死等4個角度對每個脾臟和肺臟病理切片進行評分，評分標準如下：(1)病變范圍評分：未見病變計0分，病變范圍≤25%計1分，25%<病變范圍≤50%計2分， 50%<病變范圍≤75%計3分，病變范圍>75%計4分。(2)原發(fā)損傷：未見原發(fā)病灶計0分，單個原發(fā)病灶計1分，2個或以上計2分，多個并有融合計3分，多個廣泛融合計4分。(3)繼發(fā)性損傷：未見繼發(fā)性損傷計0分，繼發(fā)性損傷范圍≤25%計1分，25%<繼發(fā)性損傷范圍≤50%計2分，50%<繼發(fā)性損傷范圍≤75%計3分，繼發(fā)性損傷范圍>75%計4分。(4)壞死：未見壞死計0分, 極輕微壞死計1分，輕微壞死計2分，中度壞死計3分,顯著壞死計4分，重度壞死計5分。

表1 不同組別結(jié)核感染豚鼠的給藥劑量與頻次

注VD組：給常規(guī)劑量維生素D3原；VDH組：給高劑量維生素D3原組；INH：異煙肼；RFP：利福平；H-R:INH+RFP；0表示不加對應(yīng)的藥物，僅給予配制該藥物的溶劑；qd:1次/d

結(jié) 果

一、豚鼠一般情況

實驗期間(包括感染和給藥期間)豚鼠未出現(xiàn)死亡。感染前豚鼠平均體質(zhì)量(310.01±13.74)g，開始灌胃前(計為0周)平均體質(zhì)量達到(491.16±35.94)g，開始給藥后豚鼠體質(zhì)量穩(wěn)步增長，每周體質(zhì)量增加(30.87±7.90)g，給藥4周和8周時豚鼠體質(zhì)量情況見表2。比較8周各組體質(zhì)量增長量，VDH組增長最快，平均增長體質(zhì)量275.63 g；而H-R 組增長最慢，平均增長體質(zhì)量155.66 g，可見單次高劑量維生素D隔周給藥有利于豚鼠體質(zhì)量增長。

二、活菌計數(shù)情況

1. 氣溶膠感染及活菌計數(shù)：豚鼠分2次(雌性和雄性)完成氣溶膠感染，分別對2次感染菌液進行活菌計數(shù)，取對數(shù)值為5.65 CFU/ml和5.55 CFU/ml，提示雌性和雄雌動物2次感染菌量一致。

2.感染10 d后活菌計數(shù)：感染10 d后隨機取4只豚鼠(雌雄各半)解剖，對肺臟和脾臟進行活菌計數(shù)，肺臟活菌計數(shù)均值為(4.56±0.07) lgCFU，感染模型建立成功。脾臟活菌計數(shù)未見生長。

3.感染28 d后活菌計數(shù)：感染28 d后隨機取4只豚鼠(雌雄各半)解剖，對肺臟和脾臟進行活菌計數(shù)作為治療前基線，肺臟活菌計數(shù)均值為(5.40±0.21) lgCFU，脾臟活菌計數(shù)均值為(4.90±0.07) lgCFU。

4.給藥4周和8周豚鼠肺臟和脾臟活菌計數(shù)：單獨維生素D治療，VD組與VDH組給藥4周和8周后均未見MTB菌落數(shù)下降。治療4周H-R組肺臟和脾臟活菌計數(shù)分別為(4.98±0.26) lgCFU和(4.02±0.03) lgCFU, H-R+VDH組肺臟和脾臟活菌計數(shù)分別為(4.39±0.11) lgCFU和(2.30±0.43) lgCFU；H-R+VDH組較H-R組肺臟和脾臟活菌計數(shù)分別下降了0.59 lgCFU和1.72 lgCFU；治療8周后H-R組肺臟和脾臟活菌計數(shù)分別為(3.73±0.23) lgCFU和(2.26±0.24) lgCFU； H-R+VDH組肺臟活菌計數(shù)為(3.21±0.23) lgCFU，脾臟達到無菌化；H-R+VDH組較H-R組肺臟和脾臟活菌計數(shù)分別下降了0.52 lgCFU和2.26 lgCFU。治療4周后H-R+VD組脾臟活菌計數(shù)為(2.36±0.10) lgCFU， H-R+VD組較H-R組脾臟活菌計數(shù)下降了1.66 lgCFU(表3)。

三、病理結(jié)果

1.肉眼觀察：解剖豚鼠可見肺臟局部腫脹和攣縮變形，表面可見大小不等的結(jié)節(jié)樣原發(fā)病灶，直徑約0.1～0.4 cm，呈灰黃色。脾臟病變可見不同，治療4周時空白對照組(圖1)豚鼠脾臟明顯腫大，表面凹凸不平，可見布滿大小不等的結(jié)節(jié)；VD組和VDH組均未觀察到病變減輕，脾臟外觀與空白對照相近；H-R組(圖2)可見脾臟水腫及少量結(jié)節(jié)樣改變；H-R+VD組(圖3)、H-R+VDH組(圖4)則能看到病變明顯減輕,脾臟變小變薄，表面光滑，結(jié)節(jié)樣病變消失，接近正常豚鼠脾臟外觀。治療8周時，空白對照組、VD組、VDH組脾臟與圖1相似；H-R組、H-R+VD組、H-R+VDH組脾臟均與圖3和圖4相似。

表2 不同組別結(jié)核感染豚鼠給藥0、 4和8周后的體質(zhì)量

注VD：給常規(guī)劑量維生素D3原；VDH：給高劑量維生素D3原；INH：異煙肼；RFP：利福平

表3 不同組別結(jié)核感染豚鼠給藥4周和8周后的肺臟和脾臟活菌計數(shù)情況

注“-”表示H-R+VDH治療組給藥8周后脾臟未見菌落生長，無法取對數(shù)值，比較該組與其他各組的差值時，以活菌計數(shù)差值的對數(shù)表示

圖1～4 治療4周后空白對照組(圖1)、H-R組(圖2)、H-R+VD組(圖3)、H-R+VDH組(圖4)的脾臟外觀

2.組織病理學(xué)：在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺臟和脾臟的病理切片并評分。對每組評分進行匯總后可見：與空白對照組比較，VD組和VDH組均未見病變減輕；而H-R+VDH組治療4周后脾臟病理評分低于其他各組(表4)，治療8周后肺臟病理評分低于其他各組(表5)。

高倍鏡下觀察：治療4 周時空白對照組肺臟病變范圍大，肉芽腫內(nèi)有大量壞死和鈣化灶，肺泡細胞被上皮樣細胞和淋巴細胞取代(圖5)；脾臟病變范圍大，組織結(jié)構(gòu)被肉芽腫病變破壞，視野內(nèi)布滿上皮樣細胞和淋巴細胞，并可見少量壞死和鈣鹽沉積(圖6)。H-R+VD 組治療8 周后肺臟未見肉芽腫及壞死，接近正常肺組織形態(tài)(圖7)。H-R+VDH組治療4周后脾臟也接近正常脾組織形態(tài)(圖8)。

表4 不同組別結(jié)核感染豚鼠給藥4周后的脾臟病理學(xué)評分

表5 不同組別結(jié)核感染豚鼠給藥8周后的肺臟病理學(xué)評分

圖5～8 分別為高倍鏡下空白對照組治療4周后的肺臟標本病理切片(圖5)和脾臟標本病理切片(圖6)，H-R+VD組治療8周后的肺臟標本病理切片(圖7)，H-R+VDH組治療4周后的脾臟標本病理切片(圖8)

討 論

結(jié)核病仍然是危害人類健康的重要傳染性疾病，耐藥結(jié)核病形勢嚴峻。化學(xué)治療是結(jié)核病防治的主要手段，目前抗結(jié)核藥物治療存在周期長、依從性差，以及二線治療藥物不良反應(yīng)多、治愈率低等問題。在抗結(jié)核新藥研發(fā)周期長、進展緩慢的情況下，開發(fā)化學(xué)輔助藥物以減輕患者癥狀，提高患者耐受性，增加療效是積極有益的嘗試。研究較多的輔助藥物主要有疫苗類藥物、細胞因子、抗體、免疫調(diào)節(jié)劑等，這些藥物大多給藥劑量和給藥時間不統(tǒng)一、療效評價指標過于單一、治療費用高，尚缺乏嚴格的多中心隨機對照試驗支持等問題。

維生素D是人體必需的脂溶性維生素，它的主要生理作用是通過其活性代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)鈣磷和骨代謝，隨著研究的深入，維生素D更廣泛的生理作用不斷被發(fā)現(xiàn)。文獻報道了維生素D缺乏與多種疾病有關(guān)，包括結(jié)核病、多發(fā)性硬化[13]、糖尿病[14]、癌癥[15]等。近年來，許多基礎(chǔ)研究報道了維生素D在結(jié)核病中的作用：體外實驗證實維生素D活性形式1,25(OH)2D3能刺激單核細胞向巨噬細胞的分化，并促進巨噬細胞的成熟，增強其殺菌能力[16-18]；維生素D還能促進巨噬細胞抗菌肽的表達[19]，并增強其殺滅MTB活性的作用；也有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D能夠調(diào)節(jié)T淋巴細胞的增殖，介導(dǎo)免疫耐受[20-21]；在C3HeB/FeJ品系小鼠的結(jié)核病模型中證實，維生素D在結(jié)核病后期能抑制免疫損傷[22]。臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏能增加糖尿病患者罹患結(jié)核病的風(fēng)險[23]，多項Meta分析數(shù)據(jù)均顯示維生素D受體基因多態(tài)性也與結(jié)核病發(fā)病相關(guān)[24-25]。然而，臨床多中心隨機對照試驗未發(fā)現(xiàn)補充維生素D能加快痰菌陰轉(zhuǎn)的陽性結(jié)果[7]；Cegielski and Vernon在關(guān)于這篇報道的評論中指出：以痰菌陰轉(zhuǎn)作為評價維生素D的療效指標不是很理想，它的作用體現(xiàn)在減輕炎癥反應(yīng)、限制組織損傷、防止復(fù)發(fā)等[26]。據(jù)此本研究擬應(yīng)用豚鼠動物模型從體質(zhì)量變化、病理改變、MTB負荷等角度評價維生素D在結(jié)核病中的輔助治療作用。豚鼠對MTB高度敏感，低劑量MTB就能使豚鼠發(fā)展成與人類相似的結(jié)構(gòu)典型的肉芽腫，可發(fā)展為壞死，且肉芽腫內(nèi)含菌量低，與人體感染MTB一樣可造成相似的病理損傷；豚鼠模型存活率高。感染初期表現(xiàn)為CD4為主的強烈的細胞反應(yīng)，而在感染30 d后表現(xiàn)為B細胞和粒細胞穩(wěn)定增加[27]，提示豚鼠建立了穩(wěn)定的免疫反應(yīng)，此時與人體感染MTB時的免疫狀態(tài)相一致。本研究模擬人體感染與發(fā)病的方式：以氣溶膠方式感染豚鼠，在感染4周后建立豚鼠慢性結(jié)核病模型，開始藥物干預(yù)性試驗。

本研究中將異煙肼和利福平的劑量設(shè)定為10 mg/kg，依據(jù)文獻[12]，在陽光充足的條件下，人體每天合成的維生素D可達到10 000～25 000 IU，而每天補充10 000～50 000 IU維生素D是安全的；另根據(jù)Daley等[7]研究中高劑量維生素D給藥方式為100 000 IU，隔周1次，據(jù)此本研究設(shè)定了2種補充維生素D的方式：每日常規(guī)劑量(10 000 IU，1次/d)和單次高劑量(100 000 IU，隔周1次)。在豚鼠慢性結(jié)核病模型中分4周和8周2個時間點評價了維生素D的輔助治療作用。筆者觀察到單獨補充維生素D未減輕豚鼠的MTB負荷，也未減輕病理損傷，而異煙肼-利福平化療輔以單次高劑量維生素D隔周給藥，治療4周后肺臟和脾臟活菌計數(shù)較單純化療分別下降了0.59和1.72 lgCFU，治療8周后肺臟和脾臟活菌計數(shù)較H-R組分別下降了0.52和2.26 lgCFU；異煙肼-利福平化療輔以每日常規(guī)劑量維生素D治療4周后脾臟活菌計數(shù)較單純化療組下降了1.66 lgCFU；在輔以單次高劑量維生素D隔周給藥4周后脾臟病理改變輕于單獨化療組，治療8周后肺臟病理改變輕于單獨化療組，顯示維生素D在豚鼠結(jié)核病中具有一定的輔助治療作用，預(yù)示臨床應(yīng)用可能在改變患者癥狀上有一定的作用和價值。

本研究存在以下不足：豚鼠體型較大、生長快，且個體間差異明顯，體質(zhì)量和臟器質(zhì)量也表現(xiàn)出較大差異，需要增大實驗動物數(shù)量才能得出更有力的結(jié)論；未能測定豚鼠血漿維生素D濃度是本研究的不足；本研究僅選取了2種補充維生素D的方式進行試驗，并未對維生素D的補充劑量進行探討，此外有研究報道了補充高劑量維生素D(60 000 IU，每周1次或600 000 IU單次給藥)的5例肉芽腫性疾病患者均發(fā)生了高鈣血癥，其中有2例患者為結(jié)核病[28]，故維生素D最佳的補充劑量仍需進一步研究探討。最后，維生素D如何在豚鼠結(jié)核病模型中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制仍存在爭議，有研究發(fā)現(xiàn)維生素D并非抑制Th1細胞分化而起免疫抑制作用[29]，探索維生素D的免疫調(diào)節(jié)作用需要進行更深入的研究。

本研究是對豚鼠結(jié)核病模型中維生素D具有一定的輔助治療作用的首次報道，給維生素D在臨床的應(yīng)用帶來新的希望。有必要對維生素D開展進一步研究，以發(fā)現(xiàn)和揭示其保護作用機制，為在結(jié)核病治療中的應(yīng)用提供充分依據(jù)。

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