秦日甜 謝占玲

（青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院 青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

植物細(xì)胞壁是獲得生物燃料最豐富的可再生原料來源［1］。果膠是以α-1，4-糖苷鍵聯(lián)接而成的聚半乳糖醛酸天然多糖，還含鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等中性糖，產(chǎn)生于高等植物初級(jí)細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)［2］。果膠作為細(xì)胞壁最復(fù)雜成分，賦予植物初生壁靈活性［3］。植物初生細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素和果膠分別占30%、30%和35%左右［4］，果膠占植物細(xì)胞壁比重較大，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)果膠酶的研究較纖維素酶等少。微生物果膠酶現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、環(huán)境領(lǐng)域、生物技術(shù)領(lǐng)域及飼料工業(yè)等領(lǐng)域［5］。果膠酶是真菌侵染植物細(xì)胞壁時(shí)最早分泌的酶類物質(zhì)，對(duì)微生物利用天然纖維質(zhì)材料起關(guān)鍵作用［6］。果膠酶主要作用于果膠類物質(zhì)，降解植物細(xì)胞壁中的果膠成分，導(dǎo)致組織解體從而引起腐爛、枯萎等癥狀，在致病過程中有重要意義［7］。Morten等［8］研究發(fā)現(xiàn)一種切葉蟻分泌的果膠酶成分作用于植物細(xì)胞壁，能加速真菌對(duì)植物組織的消化。同時(shí)，果膠酶能提高纖維素酶水解的效率，可以降解細(xì)胞間質(zhì)的果膠成分，而改變植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，增加纖維素酶和半纖維素酶在底物上的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而提高酶解效率［9］。為更好地滿足工業(yè)對(duì)高效植物細(xì)胞壁降解酶的需求，對(duì)果膠酶的研究有重要意義［10］。鐮刀菌是廣泛分布在土壤和有機(jī)體內(nèi)的真菌，營(yíng)寄生或腐生生活，常誘發(fā)萎蔫、根腐及各型腐爛，造成農(nóng)作物減產(chǎn)［11］。作為世界四大酶制劑之一，目前我國(guó)大部分果膠酶制劑仍需從國(guó)外進(jìn)口，主要問題在于分離純化的果膠酶活性較低［12］。1999年諾維信公司便推出了用基因工程改造菌種生產(chǎn)的“BiPoerp”堿性果膠酶，壟斷了中國(guó)堿性果膠酶市場(chǎng)［13］，由于國(guó)外果膠酶研究較早、技術(shù)較成熟，我國(guó)更須加快研究進(jìn)展以獲取高活力的果膠酶應(yīng)用于工業(yè)化商業(yè)化等領(lǐng)域。田飛等［14］從青藏高原通過篩選，分離鑒定了一株能高效降解植物細(xì)胞壁的鐮刀菌菌株 Q7-31T，其粗酶液降解植物細(xì)胞壁的效率明顯高于其他菌株，經(jīng)蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其含有16種糖苷水解酶類，其中1種為果膠酶，但果膠酶性質(zhì)及結(jié)構(gòu)等尚不清楚。為進(jìn)一步研究鐮刀菌侵染植物細(xì)胞壁的作用機(jī)理，本研究以鐮刀菌 Q7-31T 為實(shí)驗(yàn)材料，研究果膠酶PGL1以期對(duì)研究植物細(xì)胞壁降解機(jī)制及分離純化高活力果膠酶具有一定指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 鐮刀菌 Q7-31T 由青海大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室于 2007 年 5 月從青海湖地區(qū)分離得到現(xiàn)保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑 果膠（Pectin）、蛋白胨、十二烷基硫酸鈉（SDS）購(gòu)自 Sigma 公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）、低分子量蛋白 Marker 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Sephacry S-100、DEAE-Sepharose Fast Flow 購(gòu)自 Pharmacia 公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-M8（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）；TS-200 恒溫培養(yǎng)搖床（上海儀純實(shí)業(yè)有限公司）；250D 光照培養(yǎng)箱（吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠）；LDZX-40Ⅱ立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；UGP-VCY-1000-WxDxH生物超凈工作臺(tái)（統(tǒng)鉅凈化設(shè)備上海有限公司）；Adventurer TM 天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；UV-9200 紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；TDL-40B 型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；MD44 透析袋（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株 從液體石蠟封存的菌種中挑取直徑 0.5 cm 的瓊脂塊，接種到 PDA 平板培養(yǎng)基（馬鈴薯 200 g，蔗糖 20 g，瓊脂 15-20 g，蒸餾水 1 000 mL）中心，25℃ 恒溫培養(yǎng)箱中活化 5 d；從PDA固體培養(yǎng)基上取1.0 cm 的菌塊轉(zhuǎn)接至液體種子培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨 3 g/L，Mendels 營(yíng)養(yǎng)鹽 ：（NH4）2SO41.4 g/L、KH2PO42.0 g/L、尿素 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L、MgSO40.3 g/L、FeSO45.0 mg/L、MnSO41.6 mg/L、ZnSO41.4mg/L、CoCl22.0 mg/L，pH自然，裝液量為60 mL/150 mL），60 r/min室溫振蕩培養(yǎng)；將液體種子按 10% 接種量轉(zhuǎn)接至產(chǎn)酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基（燕麥秸稈 5 g/L，蛋白胨 8 g/L，Mendels營(yíng)養(yǎng)鹽，pH 自然，裝液量100 mL/250 mL）20℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵液經(jīng)8層無菌紗布過濾得粗酶液，于 4℃ 保存。

1.2.2 果膠酶活力的測(cè)定 果膠裂解酶作用于果膠的消除反應(yīng)使底物生成Δ-4，5-不飽和半乳糖醛酸基，酶活性測(cè)定：取適量底物溶液和酶液迅速混合，在一定條件下反應(yīng)一定時(shí)間，于235 nm下檢測(cè)吸收值，根據(jù)朗伯-比爾定律得出酶活［15］。內(nèi)切、外切纖維素酶活力測(cè)定方法參見田飛、常鑫園等［14，16］研究方法。

1.2.3 蛋白含量的測(cè)定 蛋白含量的測(cè)定采用Bradford 法［17］，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在2 mL離心管中加入適當(dāng)稀釋的蛋白樣品200 μL和1 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，在595 nm下測(cè)定光吸收值。

1.2.4 硫酸銨分級(jí)沉淀 發(fā)酵液經(jīng) 8 層無菌紗布過濾，得到粗酶液。將固體硫酸銨研磨細(xì)，緩慢加入粗酶液中，調(diào)節(jié)飽和度到 50%-90%，充分混勻后，4℃靜置 2 h，隨后 4℃、12 000×g離心 20 min 收集沉淀；沉淀以 pH 7-7.5 的 Tris-HCl緩沖液重懸，重懸液經(jīng)透析袋（MD 透析袋，北京索萊寶科技有限公司）脫鹽，4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Sephacry S-100 葡聚糖凝膠層析 硫酸銨分級(jí)沉淀后的樣品加入到 Sephacry S-100 葡聚糖凝膠層析柱（26 mm×700 mm），以 Tris-HCl 緩沖液（0.02 mol/L、pH7.0）洗脫、流速為 1.5 mL/min，用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白的分布，DNS 法測(cè)定酶的分布（方法如前文所描述）。

1.2.6 DEAE 弱陰離子交換層析 取凝膠層析柱收集的果膠酶活性部分，吸附到pH7.0 DEAE 瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱（15 mm×50 mm）上，用含有NaCl（0.02-1.00 mol/L，pH7.0）的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫（1.8 mL/min），用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白分布；樣品經(jīng) MD44 透析袋透析脫鹽后，檢測(cè)內(nèi)切葡聚糖酶的分布（方法如前所述）。

1.2.7 SDS-PAGE 用SDS-PAGE 法檢測(cè)每一步實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)分子量和分離純化過程中蛋白純度［18］。分離膠的濃度 12.5%，電泳電壓為 120 V；濃縮膠的濃度3%，電泳電壓為 80 V［19］。

1.2.8 最適溫度、pH 及穩(wěn)定性測(cè)定 最適溫度測(cè)定：將底物處于 pH7.0 的緩沖溶液中，在 20-70℃進(jìn)行酶促反應(yīng)，之后測(cè)定果膠酶的最適反應(yīng)溫度；在同上溫度水浴 30 min 后測(cè)定酶的穩(wěn)定性；最適 pH 測(cè)定：將底物處于不同 pH 的緩沖液 pH1-14 在40℃條件下反應(yīng)，然后測(cè)定果膠酶活力，確定最適反應(yīng)pH；將樣品分別在上述 pH 處理 30 min，40℃，測(cè)定酶的 pH 穩(wěn)定性。

1.2.9 底物特異性測(cè)定 分別采取濃度均為 0.5% 的果膠、羧甲基纖維素鈉、樺木木聚糖、可溶性淀粉、燕麥秸稈粉、麩皮和濾紙作為底物，酶活力測(cè)定方法參考上述內(nèi)容。

1.2.10 米氏常數(shù)測(cè)定 配制不同質(zhì)量濃度［S］的果膠底物溶液：10、8、6、4、2、1.5 mg/mL，加入酶液后40℃條件下反應(yīng)30 min。測(cè)定外切酶活。以1/V為縱坐標(biāo)，1/［S］為橫坐標(biāo)作圖，1/V與1/［S］成直線關(guān)系，從而求出 Km及Vmax，Vmax=1/b，Km=a/b。1.2.11 金屬離子對(duì)酶活力的影響 酶液中分別加入各種金屬離子化合物 ：Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+等，各種金屬離子在反應(yīng)體系中的終濃度達(dá)到 4 mmol/L。40℃作用 30 min 后測(cè)定果膠酶活力。沒有加入金屬離子的組酶活力作為 100%。

1.2.12 蛋白鑒定 蛋白鑒定由北京華大基因完成，具體實(shí)驗(yàn)方法參照田飛、Terova等［20，21］的研究。

1.2.13 數(shù)據(jù)處理與誤差分析 采用 SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行誤差分析：采用兩樣本（測(cè)定管與對(duì)照管）平均數(shù)t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.01，線性相關(guān)性極顯著；0.05＞P＞0.01，線性相關(guān)性顯著；P＞0.05，線性相關(guān)性不顯著）［22］。

1.2.14 生物信息學(xué)分析 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：應(yīng)用SOPMA在線工具對(duì)果膠酶進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；疏水性/親水性分析：應(yīng)用ProtScale Server對(duì)蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)：利用在線工具NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行潛在酸化位點(diǎn)分析；糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)：將蛋白質(zhì)氨基酸序列在丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心的網(wǎng)站，使用在線預(yù)測(cè)工具NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進(jìn)行預(yù)測(cè)；跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)：應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），對(duì)果膠酶氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；功能結(jié)構(gòu)域分析：InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/） 把 SWISS-PROT、EMBL、PROTSITE、PRINTS、PFAM、ProDom等數(shù)據(jù)庫提供的蛋白質(zhì)序列中的結(jié)構(gòu)域、motif等信息統(tǒng)一起來；三級(jí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)：通過Swiss-Model程序，運(yùn)用同源建模法對(duì)果膠酶三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 果膠酶分離純化

果膠酶活性的蛋白樣品在硫酸銨為50%-90%的飽和度條件下沉淀下來，蛋白樣品在 Tris-HCl（0.02 mol/L，pH7.5）緩沖液中重懸，脫鹽，取 20 mL 重懸液加入到 SephacryS-100 葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分級(jí)分離，如圖1所示，有P1、P2、P3三個(gè)蛋白峰。

圖1 Sephacryl S-100凝膠過濾洗脫圖譜

對(duì)具有果膠酶酶活的蛋白樣品收集起來濃縮后上樣到DEAE 瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱上進(jìn)行二次分離純化，洗脫圖譜如圖 2所示，有一個(gè)穿透峰F1 和一個(gè)洗脫峰 F2，酶活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有明顯果膠酶活力的酶樣品主要集中在 F1 處，F(xiàn)2處蛋白樣品無明顯酶活力。

圖2 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換洗脫圖譜

從圖2可以看出，存在兩個(gè)洗脫峰（F1，F(xiàn)2），經(jīng)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，果膠酶活主要集中在穿透峰F1處，而F2處的蛋白樣品無果膠酶活力。分別對(duì)粗酶液、硫酸銨沉淀后重懸液、經(jīng)過葡聚糖凝膠柱后及DEAE瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱的蛋白進(jìn)行 SDSPAGE 檢測(cè)。最終得到單一條帶，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，分子量為 36.21 kD 左右（圖 3）。以 800 mL發(fā)酵液開始，果膠酶PGL1從粗酶液到最后的純化產(chǎn)物共純化了 6.24 倍，回收率為 12.1 %，酶純化后的比活力為 62.54 U/mg，分離純化結(jié)果如表 1 所示。

圖3 分離純化蛋白的SDS-PAGE電泳圖

表1 果膠酶PGL1的純化

2.2 果膠酶酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適溫度、pH 及穩(wěn)定性測(cè)試 PGL1最適反應(yīng)溫度、pH 及其耐受情況如圖 4-A、4-B所示，最適反應(yīng)溫度為 40℃，最適反應(yīng) pH 為 8；純化的酶在 40℃下恒溫水浴 1 h 仍能維持原有酶活力的 90%以上，溫度超過 40℃ 后，酶活力開始降低，60℃水浴1 h后酶活力僅能維持原來的 45%；pH 穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該酶在 pH8. 0-10. 0 范圍內(nèi)可以保持 60%以上。

2.2.2 底物特異性檢測(cè) 該酶對(duì)果膠具有較高酶活力，對(duì)于微晶纖維素和植物細(xì)胞壁具有不明顯酶活力，對(duì)于羧甲基纖維素、淀粉、木聚糖和燕麥秸稈沒有降解活力（表2）。

圖4 PGL1最適溫度、最適pH和耐受性檢測(cè)

表2 PGL1底物特異性檢測(cè)

2.2.3 PGL1酶促反應(yīng)中動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 經(jīng)過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，由圖5計(jì)算知PGL1降解果膠的Km值為22.35 mg/mL，Vmax為23.53 μg/（mL·min）。

2.2.4 金屬離子對(duì)酶活力影響的測(cè)定 金屬離子檢測(cè)結(jié)果（圖 6）表明，Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+等對(duì) PGL1均有抑制作用，其中Na+、Zn2+有很明顯的抑制作用。

2.3 PGL1的鑒定

圖5 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

圖6 金屬離子對(duì)PGL1的果膠酶活力的影響

首先對(duì)PGL1的蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，PGL1的分子量為 36.21 kD、等電點(diǎn)為8.13；進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析先通過一級(jí)質(zhì)譜獲得蛋白的指紋圖譜（PMF），再選取有代表性的肽段，進(jìn)一步破碎后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜圖如圖 7 所示。二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果結(jié)合母離子信息和 PMF 的結(jié)果進(jìn)行搜庫（NCBI）比較，經(jīng)Mascot搜索引擎檢索，檢索得分66分（75分為陽性），NCBI注冊(cè)號(hào)為gi︱342877242（分子量為 34.31 kD，等電點(diǎn)為 8.33），它們的序列相似但并不完全相同，分子量和等電點(diǎn)與質(zhì)譜結(jié)果對(duì)應(yīng)的蛋白存在差異，酶學(xué)特性顯示為果膠酶。綜合上述研究結(jié)果，將PGL1鑒定為一種新型的PL-1家族的果膠酶。

圖7 果膠酶PGL1質(zhì)譜鑒定圖譜

2.4 果膠酶PGL1結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

通過對(duì)Q7-31T菌株的PGL1果膠酶進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、潛在磷酸化位點(diǎn)分析、糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)、跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、疏水性/親水性分析和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)一系列生物信息學(xué)分析，以探究果膠酶降解相關(guān)酶系的特點(diǎn)和對(duì)纖維素降解機(jī)制的作用。

2.4.1 果膠酶PGL1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過SOPMA在線工具對(duì)果膠酶PGL1進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖8。對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可知：果膠酶PGL1的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成元件均為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲四種，其中無規(guī)則卷曲和延伸鏈比例較高，分別占37.96%和31.17%；α-螺旋占20.06%；而β-轉(zhuǎn)角最少，僅占10.80%。

2.4.2 果膠酶PGL1的疏水性/親水性分析 對(duì)PGL1氨基酸序列的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，負(fù)值越小表示親水性越強(qiáng)，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，介于-0.5到+0.5之間的為兩性氨基酸。由圖9可看出PGL1的N端和C端親水性較強(qiáng)，而肽鏈中間部分主要表現(xiàn)為疏水性，可能與其空間結(jié)構(gòu)與對(duì)環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。

2.4.3 果膠酶PGL1的潛在磷酸化位點(diǎn) 利用NetPhos 3.1 Server對(duì)果膠酶PGL1氨基酸序列進(jìn)行潛在酸化位點(diǎn)分析。依據(jù)分值大于0.5的氨基酸位點(diǎn)都是酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該酶在絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）三個(gè)氨基酸上都具有潛在的酸化位點(diǎn)，結(jié)果如圖10所示?？梢园l(fā)現(xiàn)絲氨酸上的潛在酸化位點(diǎn)數(shù)明顯比蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化位點(diǎn)數(shù)高。果膠酶的磷酸位點(diǎn)共13個(gè)（Ser∶9；Thr∶3；Tyr∶1），相比于 Q7-31T所產(chǎn)的纖維素酶GH5-281和CBH-C的磷酸化位點(diǎn)數(shù)（45個(gè)；38個(gè)）較少［23］，說明果膠酶可能本身降解纖維素能力相對(duì)較弱，但能輔助纖維素酶更高效地降解植物細(xì)胞壁。果膠酶在植物纖維加工等方面很有應(yīng)用前景［24］。

圖8 Q7-31T果膠酶PGL1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果圖

圖9 Q7-31T菌株果膠酶PGL1疏水性/親水性分析結(jié)果圖

2.4.4 果膠酶PGL1的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用在線預(yù)測(cè)工具NetNGlyc 1.0 對(duì)PGL1的氨基酸序列進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，參數(shù)默認(rèn)，得分大于0.5即認(rèn)為為糖基化位點(diǎn)［25］。糖基化能增強(qiáng)酶蛋白對(duì)蛋白水解酶的抗性。N-糖基化能促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊、穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，對(duì)治療性蛋白也具有重要的藥理學(xué)意義［26］。預(yù)測(cè)結(jié)果分析可知，果膠酶PGL1存在2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，推測(cè)與其誘導(dǎo)合成存在很大的聯(lián)系?？赡苡捎赑GL1屬于誘導(dǎo)酶，其合成和加工受到鐮刀菌Q7-31T的嚴(yán)格調(diào)控等有關(guān)。

2.4.5 果膠酶PGL1的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 通過TMHMM Server v. 2.0，對(duì)Q7-31T果膠酶氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，由預(yù)測(cè)結(jié)果可知，果膠酶PGL1不屬于跨膜蛋白，即為分泌酶，這也與PGL1分離得到的過程相一致。

2.4.6 果膠酶PGL1的功能結(jié)構(gòu)域分析 應(yīng)用InterProScan軟件對(duì)PGL1進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖11。雖然PL-1與PL-2、PL-10家族的果膠酸裂解酶采用不同的折疊方式，但它們的催化位點(diǎn)呈現(xiàn)相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、保守功能性殘基有相同的排列方式［27］。圖11預(yù)測(cè)了PGL1的功能，揭示了PGL1是降解植物細(xì)胞壁果膠層過程中的毒力因子。

2.4.7 果膠酶PGL1的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過Swiss-Model程序，運(yùn)用同源建模法對(duì)Q7-31T果膠酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖12所示，PGL1預(yù)測(cè)的空間構(gòu)型呈中空桶狀結(jié)構(gòu)，酶的比表面積大，能與底物更大程度地接觸，這可能與酶的高效降解活性存在很大的聯(lián)系。由PGL1結(jié)構(gòu)與其他PL-1家族的果膠酶相比較，發(fā)現(xiàn)PL-1家族的果膠酶有廣泛的結(jié)構(gòu)相似性，這也表明它們由相同的祖先演化而來［28］。

2.5 果膠酶對(duì)植物細(xì)胞壁降解機(jī)制的研究

研究發(fā)現(xiàn)，PGL1是Q7-31T誘導(dǎo)降解植物細(xì)胞壁最早分泌的酶，對(duì)纖維素酶降解能力有促進(jìn)作用，由圖13可知，鐮刀菌Q7-31T降解植物細(xì)胞壁時(shí)存在“順序作用模型”。由蛋白組學(xué)分析［14］（表未給出）可知，果膠酶PGL1灰度覆蓋僅占糖苷水解酶的4.48%，但能在短時(shí)間內(nèi)降解植物細(xì)胞壁中含量較多的果膠等物質(zhì)，顯示出PGL1高效降解底物的能力。

3 討論

圖10 Q7-31T果膠酶PGL1潛在磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果圖

圖11 PGL1功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果圖

圖12 Q7-31T果膠酶PGL1三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果圖

近年來國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)微生物果膠酶生產(chǎn)菌株的篩選、育種、鑒定、發(fā)酵、酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)及酶的分子生物學(xué)特性與應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量的研究［5］，根據(jù) 2001 年 Kashyap 等［29］研究報(bào)道，果膠酶占世界食品酶中25%的銷售額，而目前我國(guó)由于對(duì)果膠酶研究較晚、實(shí)驗(yàn)技術(shù)較落后和酶系信息的不完善等導(dǎo)致果膠酶制劑大多依賴于國(guó)外進(jìn)口。本研究分離純化了具有高活力的果膠酶PGL1，得到了Q7-31T降解植物細(xì)胞壁的“順序作用模型”，并對(duì)PGL1進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。這對(duì)植物細(xì)胞壁降解機(jī)制提供一定的理論支持，且能提供分離純化高活力果膠酶的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步完善鐮刀菌屬酶系信息。本實(shí)驗(yàn)分離純化得到果膠酶PGL1，從粗酶液到最后的純化產(chǎn)物共純化了 6.24 倍，回收率為 12.1%，比徐偉等［30］純化重組菌Escherichia coliBL21/pET-pel表達(dá)的果膠酶純化倍數(shù)（1.71）更高。許多果膠酶均為Ca2+依賴型，而本研究發(fā)現(xiàn)Ca2+對(duì)PGL1有抑制作用。有研究表明PL-1 家族酶的結(jié)構(gòu)不需要金屬陽離子，因?yàn)槠涞孜镏写蠖圄人峄鶊F(tuán)都是甲基酯化的［31］。PGL1的β-轉(zhuǎn)角最少，僅占10.80%，而Kamen等［32］研究的pelC二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角占最大比例（30%）。

圖13 不同發(fā)酵時(shí)間下果膠酶和內(nèi)、外切酶活變化情況

果膠酶是參與植物細(xì)胞壁降解的重要的酶，利用β-消除機(jī)制降解果膠，能造成植物組織的斷離［20］。果膠酶是植物病原菌所必不可少的，而從青藏高原分離得到的植物病原菌Q7-31T對(duì)植物細(xì)胞壁降解具有高效性。致病菌分泌的果膠酶降解植物細(xì)胞壁是使植物通過各種誘導(dǎo)因子的檢測(cè)來識(shí)別病原體的攻擊，果膠裂解酶還可以通過釋放引起植物先天免疫的寡聚物間接地激活植物的防御系統(tǒng)［33］。圖11 也預(yù)測(cè)了PGL1 的功能， 揭示了PGL1 是降解植物細(xì)胞壁果膠層過程中的毒力因子，這與Mayans O. 等人從Aspergillus 得到的果膠酶A具有相似功能［34］，當(dāng)果膠主鏈被甲基化時(shí)，通過果膠裂解酶（微生物毒力因子）來切割。果膠裂解酶具有裂解果膠并在其非還原末端通過4-脫氧-α-D-甘露糖-4-烯醛酸糖基產(chǎn)生低聚糖的作用。本實(shí)驗(yàn)從鐮刀菌Q7-31T中分離純化得到一種具有高活力高回收率的新型PL-1家族果膠酶PGL1并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，完善了鐮刀菌屬Q(mào)7-31T酶系信息、進(jìn)一步提供了對(duì)植物細(xì)胞壁降解的作用機(jī)制信息，本研究的方法等也能為我國(guó)酶制劑的高活力生產(chǎn)提供一定的理論支持。

4 結(jié)論

本研究以0.8 % 蛋白胨為氮源，0.5% 燕麥秸稈為碳源誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)鐮刀菌Q7-31T；采用Sephacry S-100 凝膠柱層析和 DEAE 瓊脂糖弱陰離子交換柱層析對(duì)粗酶液進(jìn)行分離純化得到果膠酶PGL1；對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明：PGL1分子量為36.21 kD，等電點(diǎn)為8.13；PGL1最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng) pH 為8；在20℃ 到50℃ 和pH 8.0到10.0能保持較高穩(wěn)定性；Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+和Fe2+對(duì)PGL1有抑制作用；串聯(lián)質(zhì)譜鑒定表明該蛋白為一種新型PL-1家族果膠酶；最后通過生物信息學(xué)分析結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)功能：PGL1二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成元件中主要為無規(guī)則卷曲和延伸鏈，分別占37.96%和31.17%；PGL1兩端親水性強(qiáng)而中部疏水性強(qiáng)；磷酸化位點(diǎn)共13個(gè)（Ser∶9；Thr∶3；Tyr∶1）；PGL1存在2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)；跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示其為分泌酶；功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)出其為植物細(xì)胞壁降解的毒力因子。

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