黃自磊 章衛(wèi)民 葉偉 李賽妮 李浩華 朱牧孜

（1. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301；2. 廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

膠霉毒素（Gliotoxin）主要是由煙曲霉（Aspergillus fumigatus）產(chǎn)生的一類含硫二酮哌嗪（ETPs）類化合物，能夠結(jié)合含硫蛋白，破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)平衡［1-3］。膠霉毒素具有廣譜抑菌、抑病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，也可制備成殺菌劑和除草劑防治植物病害，有很好的應(yīng)用前景［4］。據(jù)報(bào)道，GliG、GliI和GliO是煙曲霉膠霉毒素生物合成所必須的功能基因［5］。啟動(dòng)子作為結(jié)構(gòu)基因和功能基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的必要元件，能夠募集轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶精確的起始轉(zhuǎn)錄［6-7］。近年來，絲狀真菌在新型、高活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)掘以及活性酶的研究和開發(fā)方面發(fā)展迅速，且絲狀真菌中啟動(dòng)子對(duì)其內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄活性較高，因此很多不同種屬絲狀真菌的啟動(dòng)子被發(fā)掘出來，如木霉屬（Trichoderma）pki1啟動(dòng)子，里氏木霉（T. reesei）的cbh1、tef1啟動(dòng)子和gpdA啟動(dòng)子，曲霉屬（Aspergillus）的glaA啟動(dòng)子等［8-9］。本課題組前期從深海真菌Dichotomomyces cejpii中分離得到多個(gè)膠霉毒素，它們具有良好的生物活性［10］，進(jìn)一步對(duì)該真菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明基因GliG、GliI和GliO分別編碼谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶和醛還原酶。目前，關(guān)于深海真菌D. cejpii中膠霉毒素的生物合成基因及其啟動(dòng)子的功能未見報(bào)道。本研究采用染色體步移技術(shù)對(duì)D. cejpii中膠霉毒素的生物合成關(guān)鍵基因GliG、GliI、GliO啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，并采用熒光素酶報(bào)告基因載體和潮霉素抗性基因表達(dá)載體進(jìn)行功能驗(yàn)證，從而為后期通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和異源表達(dá)以獲得更多高活性的新型膠霉毒素奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化試劑公司，北京），HiPure Plant RNA Mini Kit（美基生物科技有限公司，廣州），Genome walking kit、PrimeSTAR MAX Premix（TaKaRa，大連），2x Taq master mix（Microanalysis生物科技公司，北京），DNA Marker 2k、trans 2k plus II、1k（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），All-in-one RT Master Kit（Abm， 加 拿 大 ），TransStart Tip Green qPCR SuperMix（+Dye II）（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），細(xì)胞超聲破碎儀（Sonics，美國(guó)），GloMax 20/20熒光光度計(jì)（Promega，美國(guó)），熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）

1.1.2 菌株和載體 深海真菌Dichotomomyces cejpii分離自南海沉積物［11］，pGL3-Basic載體（淼靈生物科技有限公司，武漢），pAN7-1質(zhì)粒（淼靈生物科技有限公司，武漢），Trans5α感受態(tài)細(xì)胞（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），pEASY-T1 Cloning Kit（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），釀酒酵母BY4742，保藏于廣東省微生物研究所。

1.2 方法

1.2.1D. cejpii轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將深海真菌D. cejpii接種于YPD培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)72 h，挑取新鮮的菌絲體，利用植物RNA提取試劑盒提取RNA，利用All-in-one RT Master Kit逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并采用Hiseq2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的目的基因序列設(shè)計(jì)基因GliG、GliI、GliO引物，引物序列為：GliG（FP：5'-atgaccgaacgacc ttcttgatctcg-3'，RP ：5'-caatagtccatactccttctcgcc-3'），GliI（FP ：5'-atgcctcacgcagaaacactcccc-3'，RP ：5'-ccacctcttatccacccccaatg-3'），GliO（FP：5'-atggccaattctcgacccaacatcg-3'，RP：5'-gttgaagttatccaggattgcg-3'），以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，分析這3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因的表達(dá)水平。

1.2.2GliG、GliI、GliO啟動(dòng)子的克隆和序列分析 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，利用Genome walking kit試劑盒，設(shè)計(jì)GliG、GliI、GliO序列中特異性反向引物（表1），并利用正向引物AP3進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，并將最后一步的PCR片段利用pEASY-T1試劑盒進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化至trans5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選出陽(yáng)性克隆，利用T7-F和T7-ter引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得目的基因GliG、GliI、GliO上游啟動(dòng)子序列，并利用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）分析啟動(dòng)子序列，獲得啟動(dòng)子的核心區(qū)域。

1.2.3 啟動(dòng)子-pGL3-Basic載體及啟動(dòng)子-pAN7-1-2μ復(fù)制子載體構(gòu)建 根據(jù)克隆得到的GliG上游核心啟動(dòng)子片段以及pgpd啟動(dòng)子，設(shè)計(jì)單一酶切位點(diǎn)的引物，pgpd啟動(dòng)子上下游引物分別加酶切位點(diǎn)XhoI和Hind III，GliG核心啟動(dòng)子上下游引物分別加酶切位點(diǎn)NheI和Hind III，與pGL3-Basic載體對(duì)應(yīng)的酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建載體。GliI/GliO核心啟動(dòng)子通過環(huán)形聚合酶延伸克?。–ircular polymerase extension coloning，CPEC）技術(shù)設(shè)計(jì)同源臂引物，與線性載體進(jìn)行重疊延伸PCR構(gòu)建載體［12］：設(shè)計(jì)GliI/GliO啟動(dòng)子核心區(qū)域引物以及pGL3-Basic載體引物，保證載體和片段有20 bp重疊區(qū)域，利用Max酶進(jìn)行三步PCR反應(yīng)，程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min，克隆出目的片段和載體片段，膠回收試劑盒純化，并將克隆出的啟動(dòng)子核心目的片段以及pGL3-Basic載體片段各1 μL（濃度為50 ng/μL以上）用于10 μL PCR體系中，不加引物，進(jìn)行環(huán)化連接克隆，轉(zhuǎn)化trans5α，利用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，驗(yàn)證載體構(gòu)建結(jié)果。GliG上游核心啟動(dòng)子區(qū)域和2μ-pAN7-1載體的構(gòu)建：先利用CPEC法將酵母2μ復(fù)制子插入到pAN7-1載體中，然后利用酶切連接的方法，對(duì)GliG核心啟動(dòng)子設(shè)計(jì)BglII和PshA I酶切位點(diǎn)的上下游引物，PCR擴(kuò)增并酶切，與酶切后的2μ-pAN7-1載體連接轉(zhuǎn)化，將目的基因GliG上游核心啟動(dòng)子區(qū)域取代pgpdA啟動(dòng)子，構(gòu)建2μ-pAN7-1-GliG核心啟動(dòng)子載體，并電轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中，利用不同濃度（0、50、100、150、200 μg/mL）潮霉素抗性平板進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。

表1 目的基因GliG、GliI、GliO特異性反向引物序列

1.2.4 啟動(dòng)子熒光素酶活性檢測(cè) 將構(gòu)建成功的含有目的基因啟動(dòng)子的重組pGL3-Basic質(zhì)粒載體，空載體pGL3-Basic（陰性對(duì)照）和pgpd-pGL3-basic載體（陽(yáng)性對(duì)照，pgpd是真菌雙孢蘑菇中分離鑒定的啟動(dòng)子［13］，能有效啟動(dòng)目的基因的表達(dá)）分別轉(zhuǎn)化到trans5α感受態(tài)細(xì)胞，利用氨芐青霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落并保種。含有pGL3-basic-空載/GliG/GliI/GliO/pgpd質(zhì)粒的trans5α以及BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞分別于20 mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，當(dāng)OD值為0.8-1.0，8 000 r/min離心5 min取沉淀，并用PBS緩沖液洗滌2-3次，最后用2 mL的PBS緩沖液溶解，并進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎（振幅 40%，工作5 s/停頓5 s）10 min，10 000 r/min離心取上清置于冰上。取上清100 μL和螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑100 μL與1.5 mL EP管中混勻，用熒光光度計(jì)檢測(cè)不同重組菌上清的RU值，反應(yīng)時(shí)間為5 s。

1.2.5 潮霉素抗性基因表達(dá)驗(yàn)證 用不同濃度（0、50、100、150、200、250 μg/mL）的潮霉素抗性平板對(duì)釀酒酵母抗性進(jìn)行篩選，30℃培養(yǎng)3 d，確定潮霉素對(duì)于釀酒酵母的最適篩選濃度。制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞［14］，將 2μ-pAN7-1 載體以及 2μ-pAN7-1-GliG載體分別電轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中（1 500 V，5 ms），均勻涂布于潮霉素抗性平板中，并利用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 GliG、GliI、GliO的表達(dá)水平分析

以D. cejpii的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果表明，目的基因GliG的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于GliI基因和GliO基因（P＜0.01）（圖1-A）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，GliG對(duì)應(yīng)條帶明顯亮于GliI、GliO對(duì)應(yīng)條帶（圖1-B），說明GliG基因表達(dá)水平相對(duì)較高，在D. cejpii膠霉毒素生物合成過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 GliG、GliI、GliO啟動(dòng)子的克隆分析

通過3-4次巢式PCR反應(yīng)對(duì)D. cejpii基因組擴(kuò)增，得到對(duì)應(yīng)目的片段，I4（GliI啟動(dòng)子第4輪擴(kuò)增）約2.5 kb，O4（GliO啟動(dòng)子第4輪擴(kuò)增）約為3.1 kb，G3（GliG啟動(dòng)子第3輪擴(kuò)增）約為4 kb（圖2）。菌液PCR篩選得到陽(yáng)性克隆G1、I1、I2、O1、O2（圖3），通過與目的基因序列比對(duì)，證實(shí)均為包含目的基因啟動(dòng)子片段。

圖1 GliG、GliI、GliO的表達(dá)水平

圖2 GliI、GliO、GliG染色體步移擴(kuò)增得到的目的片段

將GliG、GliI、GliO三個(gè)基因的上游2-3 kb序列在啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.htmL）尋找啟動(dòng)子核心區(qū)域（表2），分值相對(duì)較高（最高為1），然后擴(kuò)增出這3個(gè)基因的上游區(qū)域，結(jié)果GliG基因上游500 bp，GliI基因上游700 bp，GliO基因上游300 bp（圖4）。

2.3 pGL3-basic-啟動(dòng)子載體構(gòu)建以及熒光素酶活性檢測(cè)

利用CPEC方法成功構(gòu)建了4個(gè)分別含有GliG、GliI、GliO、pgpd核心啟動(dòng)子的pGL3-Basic重組表達(dá)載體，并利用氨芐青霉素平板篩選，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證成功（圖5）。

表2 目的基因GliG、GliI、GliO啟動(dòng)子核心序列

圖4 GliG、GliI、GliO、pgpd核心啟動(dòng)子

將含有不同啟動(dòng)子核心序列的pGL3-Basic重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，對(duì)重組菌中的熒光素酶進(jìn)行RU檢測(cè)。結(jié)果（圖6）表明，含有GliG啟動(dòng)子的重組菌中熒光素酶活性遠(yuǎn)高于其他重組菌，說明GliG核心啟動(dòng)子區(qū)域具有較高的轉(zhuǎn)錄活性。

圖5 含pGL3-basic-GliG、GliI、GliO核心啟動(dòng)子的菌落PCR驗(yàn)證

圖6 pGL3-basic-空載/pgpd/GliG/GliI/GliO核心啟動(dòng)子載體在Trans5α和BL21細(xì)胞中的熒光素酶RU值

2.4 GliG-pAN7-1質(zhì)粒的構(gòu)建及潮霉素抗性的驗(yàn)證

用GliG核心啟動(dòng)子區(qū)域替換pgpdA啟動(dòng)子，構(gòu)建得到重組載體，并測(cè)序成功（圖7）。將釀酒酵母均勻涂布至不同濃度的潮霉素抗性平板，發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL濃度以上的潮霉素抗性平板上釀酒酵母的生長(zhǎng)受到明顯抑制（圖8），在200 μg/mL的潮霉素平板上基本上不生長(zhǎng)，從而確定最適宜的篩選濃度為 200 μg/mL。

圖7 2μ-pAN7-1-GliG核心啟動(dòng)子載體以及trans5α菌落PCR驗(yàn)證

圖8 不同濃度的潮霉素抗性平板篩選釀酒酵母

將2μ-pAN7-1-GliG核心啟動(dòng)子載體以及2μ-pAN7-1載體（陽(yáng)性對(duì)照）分別電轉(zhuǎn)入釀酒酵母，與陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)在200 μg/mL的潮霉素平板上，含有2μ-pAN7-1-GliG核心啟動(dòng)子載體的酵母生長(zhǎng)較快，而且菌落數(shù)較多（圖9）。挑取含有重組載體的釀酒酵母進(jìn)行菌落PCR，篩選得到陽(yáng)性克隆，并通過測(cè)序得到驗(yàn)證（圖10）。

圖9 2μ-pAN7-1-GliG核心啟動(dòng)子電轉(zhuǎn)釀酒酵母篩選（培養(yǎng)3 d）

圖10 2μ-pAN7-1-GliG核心啟動(dòng)子釀酒酵母菌落PCR驗(yàn)證

3 討論

真菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成關(guān)鍵酶需要活性較強(qiáng)的啟動(dòng)子來轉(zhuǎn)錄調(diào)控，尤其是對(duì)于一些關(guān)鍵限速酶，啟動(dòng)子的活性對(duì)于關(guān)鍵酶的高水平表達(dá)和代謝產(chǎn)物的高效生物合成至關(guān)重要［13］。在絲狀真菌中許多功能性的啟動(dòng)子已經(jīng)應(yīng)用于內(nèi)源和外源蛋白的表達(dá)，例如煙曲霉屬真菌中啟動(dòng)子用于異源表達(dá)人類白介素hIL-6，人血清白蛋白，人層粘連蛋白等，且產(chǎn)量大幅度提高［15-16］。Dolan等［5］首次對(duì)煙曲霉中膠霉毒素的生物合成基因簇及其代謝通路進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，其中GliG、GliI、GliO三個(gè)基因是膠霉毒素合成家族gli簇中不可缺少的關(guān)鍵基因，在膠霉毒素合成過程中，GliG基因編碼的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶是不可缺少的關(guān)鍵酶。目前，深海真菌D. cejpii中膠霉毒素生物合成基因的啟動(dòng)子及其功能未見報(bào)道。本研究通過對(duì)該真菌中g(shù)li簇關(guān)鍵基因啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆和功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)GliG、GliI、GliO啟動(dòng)子對(duì)這三個(gè)基因具有轉(zhuǎn)錄活性，其中GliG啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)，提示該啟動(dòng)子在膠霉毒素生物合成中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為分析gli簇基因家族基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，尋找關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并為后續(xù)激活D. cejpii中隱性或低活性的關(guān)鍵基因或基因簇，生物合成新型的膠霉毒素衍生物奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究通過對(duì)GliG基因啟動(dòng)子的研究，還找到了起始轉(zhuǎn)錄GliG的啟動(dòng)子序列，并能在酵母細(xì)胞中發(fā)揮作用，對(duì)潮霉素抗性基因能進(jìn)行有效地起始轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，提示該啟動(dòng)子可用于表達(dá)異源或外源谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶，在醫(yī)學(xué)和臨床上具有研究和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究首次對(duì)深海真菌D. cejpii中GliG、GliI、GliO三個(gè)基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆，采用熒光素酶表達(dá)載體驗(yàn)證了GliG啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，并在釀酒酵母細(xì)胞中驗(yàn)證了GliG啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄表達(dá)潮霉素抗性基因的功能。本研究為后期通過對(duì)D. cejpii膠霉毒素生物合成基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控和異源表達(dá)獲得更多高活性的新型膠霉毒素奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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