崔紅晶 周濤 邱堃佩 宋浩昌 劉新光

（廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東莞市衰老與抗衰老重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為研究衰老機(jī)制的經(jīng)典模式生物，既具有原核生物生長快、基因操作簡單的特點(diǎn)，又具有真核生物翻譯后加工修飾的功能特點(diǎn)［1］。研究酵母發(fā)現(xiàn)其具有多條比較保守的參與壽命調(diào)控的通路（如Sch9p、Tor1p 和Ras/PKA），且這些通路與哺乳動(dòng)物的信號通路都很相似。因此，通過研究酵母中人類的同源基因，可以獲得功能未知人類新基因的相關(guān)信息，為進(jìn)一步研究高等生物細(xì)胞壽命的具體機(jī)制提供理論依據(jù)。

釀酒酵母蛋白質(zhì)O-甘露糖轉(zhuǎn)移酶（ProteinO-mannosyltransferase，PMT）家族是一類進(jìn)化上保守的酶類，共有7個(gè)成員（Pmt1-7p），分為PMT1、PMT2和PMT4三個(gè)亞家族，具有50%-80%同源性，彼此之間有信息互補(bǔ)的特點(diǎn)。酵母PMT家族甘露糖基化修飾未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)翻譯后的加工成熟，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡［2-4］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示酵母PMT家族中PMT1基因缺失延長細(xì)胞的復(fù)制性壽命，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路的活性密切相關(guān)［5］。本文主要研究PMT3單基因缺失，以及PMT1與PMT3雙基因缺失對酵母細(xì)胞壽命的影響，旨為進(jìn)一步探討PMT家族其它成員在酵母壽命調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用，以及為甘露糖基化修飾反應(yīng)與人類相關(guān)疾病的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Easy Taq DNA聚合酶（貨號：AP111）、HiFi DNA聚合酶（貨號：AP131）和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用的限制性內(nèi)切酶MluⅠ購自TaKaRa公司；酵母提取物（貨號：LP0021）和胰蛋白胨（貨號：LP0042）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SD培養(yǎng)基（貨號：630411和630412）和限制性氨基酸（貨號：630414）購自Clontech公司。

1.1.2材 料釀 酒 酵 母 BY4742（MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）、PMT1基因缺失菌株（pmt1Δ）、感受態(tài)大腸桿菌（DH5α）、載體pRS306和重組載體pRS305-pmt3-ko為實(shí)驗(yàn)室保存。載體為低拷貝穿梭載體，在大腸桿菌中具有氨芐青霉素抗性，分別帶有Ura和Leu營養(yǎng)篩選標(biāo)簽。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，如表1。

1.2 方法

1.2.1PMT3基因缺失菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［6-7］。以載體pRS306為模板，PMT3-F和PMT3-R為引物，PCR擴(kuò)增PMT3基因破壞元件。采用醋酸鋰方法將破壞元件轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型酵母細(xì)胞（BY4742），經(jīng)Ura營養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基篩選。PCR鑒定陽性克隆基因組DNA，鑒定引物分別為PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物（V-Pmt3-F/V-Pmt3-R），營養(yǎng)篩選標(biāo)簽URA3基因內(nèi)部引物和PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物（URA-int-F/V-Pmt3-R），采用Easy Taq DNA聚合酶，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書進(jìn)行。

表 1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.2PMT1與PMT3雙基因缺失菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［5，8-9］。限制性內(nèi)切酶MluⅠ酶切重組載體pRS305-pmt3-ko，采用醋酸鋰方法將線性化重組載體轉(zhuǎn)化pmt1Δ酵母細(xì)胞。經(jīng)過Leu和Ura營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選，PCR鑒定陽性克隆基因組DNA，鑒定引物分別為營養(yǎng)篩選標(biāo)簽LEU2基因內(nèi)部引物（Leu-int-F/Leu-int-R），PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物（Pmt3-N-F/Pmt3- C-R），PMT3基因開放閱讀框外側(cè)引物與營養(yǎng)篩選標(biāo)簽LEU2基因內(nèi)部引物（V-Pmt3-F/Leu-int-R），PMT3基因開放閱讀框內(nèi)部引物（Pmt3-int-F/Pmt3-int-R），及鑒定pmt1Δ菌株所需的引物（V-Pmt1-F/V-Pmt1-R；URA-int-F/ V-Pmt1-R）。采用TransTaqHiFi DNA 聚合酶，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書進(jìn)行。

1.2.3復(fù)制性壽命檢測釀酒酵母復(fù)制性壽命的檢測方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［10-11］。在光學(xué)顯微鏡下利用纖維操作系統(tǒng)分離、統(tǒng)計(jì)酵母母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞的數(shù)目。采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。壽命兩組間的分析采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，復(fù)制性壽命用平均數(shù)表示。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMT3基因破壞元件擴(kuò)增結(jié)果

PMT3基因破壞元件（含URA3基因編碼序列）全長1 232 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)正確（圖1）。

圖1 PMT3基因破壞元件擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PMT3基因缺失菌株的鑒定

破壞元件轉(zhuǎn)化野生型酵母細(xì)胞（BY4742），PCR驗(yàn)證陽性克隆和野生型酵母細(xì)胞基因組DNA，結(jié)果（圖2）顯示，引物V-Pmt3-F和V-Pmt3-R所擴(kuò)增片段大小分別為1 619 bp和2 734 bp；引物URA-int-F和V-Pmt3-R所擴(kuò)增片段分別為710 bp和0 bp，結(jié)果與預(yù)期大小一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMT3基因缺失菌株（pmt3Δ）構(gòu)建成功。

圖 2 PMT3基因缺失酵母菌株的驗(yàn)證圖

2.3 PMT1與PMT3雙基因缺失菌株的鑒定

基于基因同源重組的原理，構(gòu)建PMT1與PMT3雙基因缺失菌株。PCR方法驗(yàn)證陽性克隆和野生型酵母細(xì)胞基因組DNA，結(jié)果（圖3）顯示，引物L(fēng)eu-int-F和Leu-int-R所擴(kuò)增片段大小分別為1 097 bp和0 bp；引物Pmt3-N -F和Pmt3-C-R所擴(kuò)增片段大小分別為6 502 bp和3 262 bp；引物V-Pmt3-F和Leu-int-R所擴(kuò)增片段大小分別為3 740 bp和0 bp；引物Pmt3-int-F和Pmt3-int-R所擴(kuò)增片段大小分別為0 bp和358 bp；引物V-Pmt1-F和V-Pmt1-R所擴(kuò)增片段大小分別為1 710 bp和2 932 bp；引物URA-int-F和V-Pmt1-R所擴(kuò)增片段大小分別為771 bp和0 bp，結(jié)果與預(yù)期大小一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMT1與PMT3雙基因缺失菌株（pmt1Δpmt3Δ）構(gòu)建成功。

圖 3 PMT1與PMT3雙基因缺失酵母菌株的驗(yàn)證圖

2.4 酵母菌株的復(fù)制性壽命

選取BY4742、PMT3基因缺失菌株（pmt3Δ）和雙基因缺失菌株（pmt1Δpmt3Δ），檢測酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命。結(jié)果（圖4）顯示，與BY4742酵母細(xì)胞的壽命（平均26代）比較，pmt3Δ菌株的壽命無明顯變化，平均壽命為24代（P＞ 0.05），pmt1Δpmt3Δ菌株的壽命也無明顯變化，平均壽命為25代（P＞ 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMT3基因缺失不影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，PMT1和PMT3雙基因缺失也不影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命。

3 討論

釀酒酵母PMT家族參與調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯后的糖基化修飾反應(yīng)，這一糖基化修飾反應(yīng)在多種細(xì)胞生物學(xué)功能中起著非常重要作用［12-15］。酵母PMT家族成員之間易形成聚合體，且主要以Pmt1p-Pmt2p、Pmt3p-Pmt5p和Pmt4p-Pmt4p幾種聚合體形式存在，并最大發(fā)揮其生物學(xué)功能。在敲除一個(gè)基因的前提下，Pmt1p-Pmt3p或Pmt2p-Pmt5p也可形成聚合體，這種協(xié)同補(bǔ)償作用能維持酵母細(xì)胞內(nèi)甘露糖轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長與增殖［16］。

圖4 BY4742、pmt3Δ菌株和 pmt1Δpmt3Δ菌株復(fù)制性壽命曲線圖

釀酒酵母是以非對稱性分裂的方式出芽，每次都能分裂出一個(gè)比自己小的子細(xì)胞，通過研究酵母母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞的數(shù)量，反應(yīng)酵母細(xì)胞的分裂增殖能力［17］。本課題組前期研究結(jié)果提示PMT家族中PMT1基因缺失延長酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，PMT2基因缺失對酵母細(xì)胞的壽命無明顯影響［5，18］。為探討PMT家族其它成員基因缺失與細(xì)胞分裂增殖之間的關(guān)系，本文研究PMT3基因缺失對酵母細(xì)胞復(fù)制性壽命的影響，基于基因同源重組的原理［5，9］，構(gòu)建了PMT3單基因缺失酵母菌株，重組發(fā)生在染色體水平上，表型穩(wěn)定遺傳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失PMT3基因沒有影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，提示酵母PMT家族單基因?qū)?xì)胞的正常分裂增殖來說是非必需的。

研究已報(bào)道PMT家族中雙基因缺失的酵母細(xì)胞表現(xiàn)為甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性降低，細(xì)胞形態(tài)變化，生長缺陷等特征。三基因缺失的酵母細(xì)胞僅在滲透壓穩(wěn)定環(huán)境中存活［19］。如PMT1和PMT2雙基因缺失的酵母細(xì)胞甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性約為野生型酵母細(xì)胞的20%，雙基因或三基因缺失的酵母細(xì)胞內(nèi)可見多個(gè)核仁，細(xì)胞生長較慢等表型特征，推測這可能與細(xì)胞內(nèi)甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性過低相關(guān)［20］。為進(jìn)一步探討雙基因缺失對酵母細(xì)胞分裂增殖的影響，本文研究PMT1與PMT3雙基因缺失菌株的復(fù)制性壽命，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMT1與PMT3雙基因缺失對酵母細(xì)胞的壽命無明顯影響。推測此雙基因缺失影響了Pmt1p-Pmt3p聚合體的形成，但并不影響Pmt2p-Pmt5p等其它聚合體的生物學(xué)功能，提示PMT家族其它成員可能補(bǔ)償了雙基因缺失在細(xì)胞內(nèi)的生理功能，但具體的機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

基于基因同源重組的原理，本文成功構(gòu)建釀酒酵母PMT3單基因缺失菌株和PMT1與PMT3雙基因缺失菌株。通過酵母光學(xué)顯微鏡檢測野生型酵母菌株和基因缺失酵母菌株的復(fù)制性壽命，結(jié)果顯示缺失PMT3基因不影響酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，且PMT1和PMT3 雙基因缺失菌株的壽命亦無明顯變化。

致謝：感謝美國華盛頓大學(xué)Matt Keaberlein教授和美國BUCK衰老研究所Brian K Kennedy博士贈(zèng)送的BY4742菌株和質(zhì)粒，以及在酵母實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面給予的精心指導(dǎo)。

［1］ Steinkraus KA, Kaeberlein M, Kennedy BK. Replicative aging in yeast：the means to the end［J］.Annual Review of Cell and Developmental Biology l, 2008, 24：29-54.

［2］ Goder V, Melero A. Protein O-mannosyltransferases participate in ER protein quality control［J］.Journal of Cell Science, 2011,124：144-153.

［3］ Xu C, Wang S, Thibault G, et al. Futile protein folding cycles in the ER are terminated by the unfolded protein O-mannosylation pathway［J］.Science, 2013, 340（6135）：978-981.

［4］ Gentzsch M, Immervoll T, Tanner W. Protein O-glycosylation inSaccharomyces cerevisiae：the protein O-mannosyltransferases Pmt1p and Pmt2p function as heterodimer［J］.FEBS Letters,1995, 377（2）：128-130.

［5］ Cui HJ, Liu XG, McCormick M, et al. PMT1 deficiency enhances basal UPR activity and extends replicative lifespan ofSaccharomyces cerevisiae［J］.Age（Dordr）, 2015, 37（3）：9788.

［6］ 方炳雄, 趙煒, 崔紅晶等. 釀酒酵母壽命的研究方法及進(jìn)展［J］.國際老年醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 34（1）：28-34.

［7］ Zhao W, Zheng HZ, Zhou T, et al. CTT1 overexpression increases the replicative lifespan of MMS-sensitiveSaccharomyces cerevisiaedeficient in KSP1［J］.Mechanisms of Ageing and Development,2017, 164：27-36.

［8］ Kaeberlein M, McVey M, Guarente L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity inSaccharomyces cerevisiaeby two different mechanisms［J］.Genes and Development, 1999, 13（19）：2570-2580.

［9］ Zhao W, Fang BX, Niu YJ, et al. Nar1 deficiency results in shortened lifespan and sensitivity to paraquat that is rescued by increased expression of mitochondrial superoxide dismutase［J］.Mechanisms of Ageing and Development, 2014. 138：53-58.

［10］ Steffen KK, Kennedy BK, Kaeberlein M. Measuring replicative life span in the budding yeast［J］.Jove-Journal of Visualized Experiment, 2009（28）. pii：1209. doi：10. 3791/1209.

［11］ Chen YQ, Liu XG, Zhao W, et al. MET18 Deficiency increases the sensitivity of yeast to oxidative stress and shortens replicative lifespan by inhibiting catalase activity［J］.Biomed Research International, 2017, 2017：7587395.

［12］ Loibl M and Strahl S. Protein O-mannosylation：what we have learned from baker’s yeast［J］.Biochim Biophys Acta, 2013,1833（11）：2438-2446.

［13］ Chugh S, Meza J, Sheinin YM, et al. Loss of N-acetylgalactosaminyl transferase 3 in poorly differentiated pancreatic cancer：augmented aggressiveness and aberrant ErbB family glycosylation［J］.British Journal Cancer, 2016, 114（12）：1376-1386.

［14］ He Z, Luo L, Keyhani NO, et al. The C-terminal MIR-containing region in the Pmt1 O-mannosyltransferase restrains sporulation and is dispensable for virulence in Beauveria bassiana［J］.Appl Microbiol Biotechnol, 2017, 101（3）：1143-1161.

［15］ Guo M, Tan L, Nie X, et al. The Pmt2p-Mediated Protein O-Mannosylation is required for morphogenesis, adhesive properties, cell wall integrity and full virulence of Magnaporthe oryzae［J］.Frontiers in Microbiology, 2016, 7：630.

［16］ Willer T, Brandl M, Sipiczki M, et al. Protein O-mannosylation is crucial for cell wall integrity, septation and viability in fission yeast［J］.Mol Microbiol, 2005, 57（1）：156-170.

［17］ Okada M, Kusunoki S, Ishibashi Y, et al. Proteomics analysis for asymmetric inheritance of preexisting proteins between mother and daughter cells in budding yeast［J］.Genes to Cells, 2017, 22（6）：591-601.

［18］ 崔紅晶, 何欣, 袁源, 等. 酵母PMT2基因菌株構(gòu)建及其對復(fù)制性壽命的影響［J］. 廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 33（5）：506-511.

［19］ Gentzsch M, Tanner W. The PMT gene family：protein O-glycosylation inSaccharomyces cerevisiaeis vital［J］.EMBO Jouranl, 1996, 15（21）：5752-5759.

［20］ Argyros R, Nelson S, Kull A, et al. A phenylalanine to serine substitution within an O-protein mannosyltransferase led to strong resistance to PMT-inhibitors inPichia pastoris［J］.PLoS One,2013, 8（5）：e62229.