武海月 趙爽 劉宇 李華敏 宋爽 牛玉蓉 榮成博

（1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所 北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京 100097；2. 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3. 北京農(nóng)學(xué)院資源與環(huán)境系，北京 102206；4. 魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，煙臺(tái) 264025）

榆黃菇（Pleurotus citrinopileatus）又名金頂側(cè)耳、金頂蘑，屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae）， 側(cè) 耳 屬（Pleurotus（Fr.）Quel.）［1］。其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，其中氨基酸含量尤為豐富，且必需氨基酸含量高［2］。榆黃菇屬高營養(yǎng)、低熱量食品，長期食用，有降低血壓、降低膽固醇含量的功能，是老年人心血管疾病患者和肥胖癥患者的理想保健食品［3］。

榆黃菇的人工栽培開始于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)在已經(jīng)能夠進(jìn)行周年栽培。但是到目前為止，在栽培上大都將采集的野生菌株直接用于生產(chǎn)，或者經(jīng)過篩選馴化后作生產(chǎn)用菌種，新品種選育的報(bào)道較為少見［4］。食用菌種質(zhì)資源是優(yōu)良品種育種的基礎(chǔ)材料，育種成效除了取決于掌握種質(zhì)資源的數(shù)量，還很大程度取決于對(duì)這些種質(zhì)資源多樣性的遺傳特性掌握。分子標(biāo)記作為食用菌遺傳多樣性研究中的一個(gè)重要手段，其應(yīng)用越來越廣泛［5］。

ISSR 是由 Zietkeiwitcz等［6］1994年創(chuàng)建的一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，結(jié)合了RAPD和SSR方法的優(yōu)點(diǎn)，是一種具有穩(wěn)定性和高重復(fù)性的分子標(biāo)記方法，被廣泛應(yīng)用于食用菌方向［7-8］。SRAP是一種由美國加州大學(xué)Li等［9］開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)，利用上游引物針對(duì)外顯子區(qū)域，下游引物對(duì)內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，上游引物和下游引物自由結(jié)合，配對(duì)出不同組合進(jìn)行反應(yīng)。由于物種及個(gè)體間的差異導(dǎo)致內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列不同進(jìn)而產(chǎn)生多態(tài)性。

由于每一個(gè)方法的開發(fā)原理不同，聚類分析結(jié)果通常會(huì)存在較大的差異，將多個(gè)分子標(biāo)記綜合運(yùn)用能最大優(yōu)化聚類分析結(jié)果。目前，榆黃菇還沒有系統(tǒng)的遺傳多樣性分析，鑒于此，本研究采用ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記的方法，對(duì)收集自全國19個(gè)榆黃菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性研究，旨為榆黃菇的分類鑒定、遺傳育種和種質(zhì)資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所用菌株的名稱及來源參見表1。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（BD Difco），蛋白胨（OXIOD），分析純磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學(xué)試劑，均購自國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司；2×TaqPCR MasterMix購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；所有引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉40 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、VB110 mg、水1 000 mL。

表1 供試菌株及其來源

1.1.3 儀器 PCR儀（Eppendorf Mastercycler Gradient）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、紫外可見分光光度計(jì)（Labtech UV9100）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、電子分析天平（奧豪斯）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 取在PDA平板上活化7-10 d的榆黃菇菌種，刮取少量菌絲作為實(shí)驗(yàn)材料，DNA的提取參照許峰等［10］方法。ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照馮偉林等［11］方法，ISSR-PCR反應(yīng)的總體積為 25 μL，體系為 ：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L 引 物（1 μL），20-50 ng DNA（1 μL），加滅菌雙蒸水（10.5 μL）至 25 μL。將反應(yīng)液按上述體積加入0.2 mL 離心管中，混勻，放入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

ISSR-PCR程序設(shè)定：94℃預(yù)變性4 min，然后94℃變性30 s，以低于引物Tm值溫度5℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

SRAP擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照邊銀丙等的方法［12］，SRAP-PCR 反應(yīng)的總體積為 25 μL，體系 為 ：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L引物 R（1 μL）、引物 F（1 μL），20-50 ng DNA（1 μL），加滅菌雙蒸水（9.5 μL）至 25 μL。將反應(yīng)液按上述體積加入0.2 mL 離心管中，混勻，放入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

SRAP-PCR程序設(shè)定：94℃預(yù)變性7 min，94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，共38個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

取8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（2%），置于紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄。（所用引物參見表2-3）

表2 ISSR分析用引物

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及分析 上述電泳圖譜中同一水平上將擴(kuò)增出的強(qiáng)帶或分辨性好的弱帶，均視為擴(kuò)增陽性，并賦值“1”，未擴(kuò)增出條帶視為擴(kuò)增陰性，賦值“0”，用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 供試菌株ISSR分析結(jié)果

以提取的19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板，通過對(duì)不同引物的PCR擴(kuò)增篩選，選出10條引物（表2）在供試菌株上擴(kuò)增效果良好，每個(gè)菌株都可以通過PCR擴(kuò)增出DNA條帶，且條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好、分布合理。10條引物共擴(kuò)增出102條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為80個(gè)，多態(tài)性為78.4%（表4）。

表3 SRAP分析用引物

不同引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)不等，其序列長度大多為200-2 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態(tài)信息（圖1-圖2）。

2.2 供試菌株SRAP分析結(jié)果

以提取的19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板，通過對(duì)不同引物的PCR擴(kuò)增篩選，獲得的10對(duì)引物（表3）在供試菌株上擴(kuò)增效果良好，每個(gè)菌株都可以通過PCR擴(kuò)增出DNA條帶，且條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好、分布合理。10對(duì)引物共擴(kuò)增出92條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為70條，多態(tài)性為76.1%（表5）。

不同引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)不等，其序列長度大多為200-2 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態(tài)信息（圖3-圖4）。

2.3 供試菌株聚類分析結(jié)果

綜合20條引物擴(kuò)增出的194條DNA片段，其中多態(tài)性條帶150條，多態(tài)性達(dá)77.3%。用NTSYSpc 2.10軟件對(duì)19個(gè)榆黃菇供試菌株進(jìn)行聚類分析，獲得各菌株間的聚類圖（圖5）。

根據(jù)聚類分析結(jié)果可知，在相似系數(shù)為0.70水平上，可將19個(gè)供試榆黃菇菌株分為4大類，表明19個(gè)供試榆黃菇菌株間具有較大的遺傳差異，第一類包括01號(hào)、03號(hào)、04號(hào)、06號(hào)，第二類包括02號(hào)、05號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、17號(hào)，第三類為13號(hào)，第四類包括07號(hào)、08號(hào)、09號(hào)、10號(hào)、14號(hào)、18號(hào)、19號(hào)；而在 0.96的相似值水平上，除09號(hào)和10號(hào)兩個(gè)菌株未區(qū)分開外，其余17個(gè)菌株均可單獨(dú)分開。

表4 ISSR多態(tài)性

圖1 引物P4對(duì)19株榆黃菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

食用菌菌種的鑒定和保護(hù)是食用菌產(chǎn)業(yè)的重要問題，市場(chǎng)上常出現(xiàn)“同名異物“或”同物異名”的現(xiàn)象，不僅不利于育種者的積極性也給生產(chǎn)者帶了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。傳統(tǒng)的菌種鑒別是在子實(shí)體層次對(duì)子實(shí)體的顏色、大小、朵型等形態(tài)特征及其生理生化反應(yīng)特征、栽培特性等為依據(jù)，易受生長環(huán)境的影響，一般只能鑒定到屬內(nèi)種間這一水平，而對(duì)于種內(nèi)菌株卻難以鑒別，且整個(gè)鑒定流程時(shí)間長、準(zhǔn)確率低［3］。

表5 SRAP多態(tài)性

圖2 引物826對(duì)19株榆黃菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 引物me2/em2 對(duì)19株榆黃菇菌株的擴(kuò)增結(jié)果

圖5 19個(gè)榆黃菇菌株的聚類分析圖

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有多種分子標(biāo)記技術(shù)（RAPD，ISSR 和 SRAP）應(yīng)用于食用菌的分類鑒定［13］。周潔等［8］利用11個(gè)ISSR引物對(duì)40個(gè)姬菇雜交菌株及2個(gè)親本菌株進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，42個(gè)供試菌株遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.428 6-0.853 7，在相似系數(shù)0.668 0時(shí)，42個(gè)菌株聚為7類，兩親本各具一類，雜交菌株與親本菌株遺傳差異較大。許峰等［10］利用9對(duì)SRAP引物對(duì)22個(gè)白色金針菇進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)0.820水平時(shí)，將供試菌株分為5大類，技術(shù)揭示了北京地區(qū)金針菇菌株的遺傳多樣性。張靜等［14］運(yùn)用SRAP，ISSR和RAPD技術(shù)對(duì)40個(gè)雙胞蘑菇進(jìn)行分析，其中SRAP平均多態(tài)率為70.21%；ISSR平均多態(tài)率為78.33%；RAPD平均多態(tài)率為61.94%，根據(jù)距離值不同，將40個(gè)雙孢蘑菇分為6個(gè)或9個(gè)類群，更好的解釋供試菌株間的親緣關(guān)系。目前國內(nèi)的分子標(biāo)記技術(shù)在香菇［15］、木耳［16］等食用菌方面應(yīng)用較廣泛，但榆黃菇的報(bào)道較少，張秋勝等［17］和崔丹等［18］僅運(yùn)用ISSR技術(shù)分析榆黃菇的遺傳多樣性。由于每一個(gè)方法的開發(fā)原理不同，聚類分析結(jié)果通常會(huì)存在比較大的差異，將多個(gè)分子標(biāo)記綜合運(yùn)用能最大優(yōu)化聚類分析結(jié)果［19］。

本實(shí)驗(yàn)共收集了不同地區(qū)的19個(gè)榆黃菇品種，通過ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)，利用篩選的引物以19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一共擴(kuò)增出194條DNA片段，其中，多態(tài)性條帶有150個(gè)，多態(tài)性比例為50%-100%不等，平均為77.3%，說明19種榆黃菇遺傳多樣性比較豐富，可以利用和開發(fā)的菌種資源較多；不同引物擴(kuò)增出每種DNA的條帶數(shù)量不等，為3-13條，擴(kuò)增出的DNA片段的分子量大多為200-2 000 bp，包含了豐富的多態(tài)性。聚類分析結(jié)果表明：19株榆黃菇菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.67-0.95，在相似系數(shù)為0.70水平上，可將19個(gè)供試榆黃菇菌株分為4大類。7號(hào)和8號(hào)菌株同是引自山東莒縣的菌株，聚類分析結(jié)果中聚為一簇，說明榆黃菇品種存在一定的地域性；11號(hào)和16號(hào)是來自不同地區(qū)的品種，親緣關(guān)系雖然較近，但是仍然存在一定的差異，說明不是一個(gè)品種或同一品種通過不斷的傳代已經(jīng)發(fā)生遺傳變異；通過目前的手段沒有能夠區(qū)分9號(hào)和10號(hào)菌株，說明二者的親緣關(guān)系很近，且兩種菌株都是來自于江蘇高郵，可能是同物異名。

本研究應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平上系統(tǒng)分析評(píng)估榆黃菇種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為榆黃菇種質(zhì)資源的鑒定、保護(hù)和育種提供了理論支持。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選出適合供試榆黃菇菌株的10條ISSR引物和10對(duì)SRAP引物，利用篩選的引物以19個(gè)供試榆黃菇菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一共擴(kuò)增出194條DNA片段，其中，多態(tài)性條帶有150個(gè)，多態(tài)性比例為50%-100%不等，平均為77.3%，說明19個(gè)榆黃菇遺傳多樣性比較豐富；不同引物擴(kuò)增出每種DNA的條帶數(shù)量不等，為3-13條，擴(kuò)增出的DNA片段的分子量大多為200-2 000 bp，包含了豐富的多態(tài)性。聚類分析結(jié)果表明：在相似系數(shù)為0.70水平上，可將19個(gè)供試榆黃菇菌株分為4大類，表明19個(gè)供試榆黃菇菌株間具有較大的遺傳差異。

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