馬鴻飛 崔寶凱 員瑗 陳圓圓 戴玉成 司靜

（北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所，北京 100083）

當(dāng)前，環(huán)境污染、能源危機(jī)和糧食短缺等這些世界性的難題亟待解決［1-3］。纖維素作為自然界中分布最為廣泛且最為豐富的一類可再生資源，是由葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵鏈接而成的碳水化合物，將其加以開發(fā)利用對于解決上述問題具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義［4-6］。近年來，已經(jīng)開發(fā)了一些纖維素資源利用技術(shù)，但仍存在轉(zhuǎn)化利用率低、操作時間長、成本高等局限性［7-9］。研究發(fā)現(xiàn)，生物降解是利用纖維素最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的手段，即通過微生物等產(chǎn)生的纖維素酶催化水解纖維素［10-14］。因此，纖維素酶的相關(guān)研究已成為當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)。

纖維素酶是一類可用于多種工業(yè)領(lǐng)域如醫(yī)藥、紡織制造、環(huán)保、食品加工、生物能源等的酶制劑［15-17］，能夠催化水解纖維素生成葡萄糖，根據(jù)其性質(zhì)和功能可分為3大類：（1）內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1，4-D-glucanase，EC 3.2.1.4），該酶可隨機(jī)水解纖維素分子鏈中的β-1，4-糖苷鍵，形成新的還原末端；（2）外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91），該酶沿纖維素鏈末端水解，依次釋放纖維二糖；（3）β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21），該酶主要將由內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶水解產(chǎn)生的纖維二糖、寡糖及低聚糖繼續(xù)水解生成葡萄糖［18-21］。纖維素酶的產(chǎn)生菌主要包括真菌、細(xì)菌等［22-27］，其中真菌產(chǎn)生的纖維素酶酶系結(jié)構(gòu)較完整，且多為胞外酶，便于后期的分離提?。?8-31］，但其生產(chǎn)成本高，仍是阻礙纖維素酶廣泛應(yīng)用的主要因素，體現(xiàn)在因菌株自身的特性和培養(yǎng)條件等使得纖維素酶的活力相對較低、所需發(fā)酵時間相對較長等方面［32-35］。因此，尋找高產(chǎn)纖維素酶真菌菌株、優(yōu)化其產(chǎn)酶條件是利用纖維素酶水解纖維素的關(guān)鍵步驟。

我國真菌資源十分豐富，截止到2010年為止，已發(fā)現(xiàn)的真菌總數(shù)達(dá)14 060種［36］。薄孔菌屬（Antrodia），隸屬于真菌界（Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），擬層孔菌科（Fomitopsidaceae），是重要的褐腐真菌（Brown rot fungi），同時其中一些種類也是纖維素酶的主要產(chǎn)生菌［37-39］。竹生薄孔菌（Antrodia bambusicolaY.C. Dai & B.K. Cui）是由Cui等［40］于2011年發(fā)表的一個新種，主要分布于我國安徽、福建等地，只生長在竹子上，目前還未見有報(bào)道對其產(chǎn)纖維素酶能力進(jìn)行深入探索。

因此，本研究主要是將竹生薄孔菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定其產(chǎn)纖維素酶能力，并利用響應(yīng)面Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)、Box-Behnken設(shè)計(jì)對其培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為天然纖維素酶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 竹生薄孔菌（Antrodia bambusicola）菌株Dai 11901，采自安徽省黃山市黃山風(fēng)景區(qū)的竹子，經(jīng)分離純化獲得，現(xiàn)保藏于北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所。

1.1.2 試劑 瓊脂粉、Tween 80、CoCl2·6H2O 和 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）購自Sigma；其他試劑為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH 5.0，1×105Pa高壓滅菌30 min，待指溫可觸時加入終濃度為0.01 g/L已過濾除菌的維生素B1，充分混勻備用。

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母浸粉 5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH 5.0，1×105Pa高壓滅菌30 min，待指溫可觸時加入終濃度為0.01 g/L已過濾除菌的維生素B1，充分混勻備用。

產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，麩皮10.0 g/L，Tween 80 3.0 mL/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CoCl2·6H2O 0.03 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，CaCl20.5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH 5.0，1×105Pa高壓滅菌30 min，待指溫可觸時加入終濃度為0.01 g/L已過濾除菌的維生素B1，充分混勻備用。

1.2 方法

1.2.1 活化及培養(yǎng) 于固體平板培養(yǎng)基上活化，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d備用。

1.2.2 種子發(fā)酵及液體培養(yǎng) 取250 mL三角瓶分裝100 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，接種5 個直徑1 cm菌餅，于搖床28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)9-10 d。內(nèi)切式勻漿機(jī)將種子發(fā)酵菌液制成懸液，充分振蕩備用。

將種子發(fā)酵懸液以5.0%（體積比）的接種量加入含100 mL產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基 Plackett-Burman設(shè)計(jì)：利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對可能影響竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶的11個因子，即葡萄糖（X1）、蛋白胨（X2）、麩皮（X3）、Tween 80（X4）、KH2PO4（X5）、MgSO4（X6）、CoCl2（X7）、FeSO4（X8）、CaCl2（X9）、ZnSO4（X10）和維生素 B1（X11），進(jìn)行篩選試驗(yàn)。每個因子取高（+1）、低（-1）兩個水平，見表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)12，重復(fù)3次，響應(yīng)值為纖維素酶活性，見表2。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行。對于單因子試驗(yàn)，該模型可描述為：

其中，Y為響應(yīng)值，即竹生薄孔菌纖維素酶活性，β0為截距，βi為線性系數(shù)，Xi為編碼變量。

最陡爬坡設(shè)計(jì)：在Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行最陡爬坡設(shè)計(jì)。根據(jù)顯著因子對竹生薄孔菌纖維素酶活性的影響效應(yīng)大小設(shè)定步長及變化方向，快速逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。因子的取值根據(jù)各因子效應(yīng)的正負(fù)和大小確定，將正效應(yīng)因子的值逐步增加，負(fù)效應(yīng)因子的值逐步減小，見表3。

Box-Behnken設(shè)計(jì)：基于Plackett-Burman設(shè)計(jì)與最陡爬坡設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)確定影響竹生薄孔菌纖維素酶活性主要因子的水平。根據(jù)已確定的4個主要因子及中心實(shí)驗(yàn)值，以纖維素酶為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因子三水平試驗(yàn)29，中心點(diǎn)5，見表4。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的二次方程，分析各因子的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值。試驗(yàn)因子可編碼為：

其中，xi為編碼變量，Xi為因子水平，X0為因子Xi在中心點(diǎn)的水平，?Xi為因子步長。

則二次多元回歸方程被描述為：

其中，Y為響應(yīng)值，即竹生薄孔菌纖維素酶活性，xi和xj均為編碼變量，β0為截距，βi、βii和 βij分別為一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)系數(shù)。

1.2.4 樣品制備 培養(yǎng)一定時間后取樣，將整瓶培養(yǎng)物抽濾，所得培養(yǎng)液經(jīng)12 000 r/min離心20 min，上清液即為纖維素酶粗酶液。

1.2.5 纖維素酶活性測定 采用DNS法測定濾紙纖維素酶活性［41］。

DNS試劑配制：準(zhǔn)確稱取3.15 g DNS溶于500.0 mL去離子水中，攪拌5 s，水浴至45℃。后加入100.0 mL 0.2 g/mL氫氧化鈉溶液，期間不斷攪拌，直到溶液清澈透明。再逐步添加91.0 g四水酒石酸鉀鈉、2.5 g苯酚和2.5 g無水亞硫酸鈉，45℃水浴加熱，補(bǔ)加300.0 mL去離子水，期間不斷攪拌，直至加入的物質(zhì)完全溶解，冷卻至25℃后用去離子水定容至1.0 L，避光保存7 d后備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)確配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.5 mL上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于7支20 mL具塞刻度試管中，加入1.5 mL DNS試劑，搖勻沸水浴5 min，取出冷卻后用去離子水定容至20.0 mL，充分混勻。于540 nm處測定吸光值，設(shè)3 個重復(fù)，求平均值。以反應(yīng)體系中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：y= 0.057 6x-0.013 6，相關(guān)系數(shù)R2= 0.997 1。

濾紙纖維素酶活性測定：吸取0.5 mL酶液和1.5 mL 0.05 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）加入20 mL具塞刻度試管中，50℃水浴保溫10 min后，加入50 mg濾紙條（約1 cm × 6 cm），50℃水浴保溫1 h，取出立即加入1.5 mL DNS試劑，煮沸5 min后取出冷卻，用去離子水稀釋至20 mL。于540 nm處測定吸光值，設(shè)3 個重復(fù)，求平均值。向已吸取酶液和緩沖液的試管中直接加入DNS試劑以鈍化酶活，作為空白對照。定義1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）、t-檢驗(yàn)和LSD檢驗(yàn)。*P＜ 0.05和**P＜ 0.01分別為差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 竹生薄孔菌在液體培養(yǎng)條件下產(chǎn)纖維素酶活性的變化

圖1顯示了褐腐真菌竹生薄孔菌在液體培養(yǎng)條件下產(chǎn)纖維素酶的變化?？梢钥吹剑谂囵B(yǎng)的20 d內(nèi)，竹生薄孔菌纖維素酶活性呈先上升后下降的趨勢，前1-6 d內(nèi)，酶活勻速上升，到第6天達(dá)到一個小的峰值（8.49 U/mL）；隨后略有下降，到第7天酶活為5.29 U/mL；從第7天開始，酶活直線上升，到第10天達(dá)到最大值，為18.70 U/mL；此后隨著培養(yǎng)時間的延長，酶活逐步下降，其中以第14-15天內(nèi)的下降幅度最大；到培養(yǎng)第20天時，測得的酶活僅為0.83 U/mL。由上述可知，若以得到纖維素酶為目的進(jìn)行液體培養(yǎng)，則第10天是其最佳的酶液收獲期；以下利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶液體培養(yǎng)基的試驗(yàn)均設(shè)在培養(yǎng)第10天取樣。

圖1 竹生薄孔菌液體培養(yǎng)過程中纖維素酶活性的變化

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶液體培養(yǎng)基

2.2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 選取試驗(yàn)次數(shù)為12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)考察葡萄糖（X1）、蛋白胨（X2）、麩皮（X3）、Tween 80（X4）、KH2PO4（X5）、MgSO4（X6）、CoCl2（X7）、FeSO4（X8）、CaCl2（X9）、ZnSO4（X10）和維生素B1（X11）這11個因子對竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶能力的影響。各因子分別取高（+1）、低（-1）兩個水平，以纖維素酶活性為響應(yīng)值，見表1和2。利用Design Expert 8.0.6軟件得到單因子線性模型：

該模型P值為0.031 7，判定系數(shù)R2和校正判定系數(shù)R2分別為0.998 7和0.992 6，說明該線性模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合程度較高，應(yīng)用于實(shí)際預(yù)測后誤差也較小。此外，X1、X2、X3、X4、X6、X7和X11的P值均小于0.05，說明它們對竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶能力的影響顯著，根據(jù)線性模型系數(shù)大小可將因子的影響程度排序?yàn)閄3＞X4＞X7＞X1＞X2＞X11＞X6，選其中的葡萄糖（X1）、麩皮（X3）、Tween 80（X4）和CoCl2（X7）作為最陡爬坡設(shè)計(jì)研究對象。在選取的4個因子中，因子葡萄糖（X1）的系數(shù)為負(fù)數(shù)，適當(dāng)減少劑量可提高纖維素酶活性，為負(fù)效應(yīng)因子；其他因子麩皮（X3）、Tween 80（X4）和 CoCl2（X7）的系數(shù)為正數(shù)，適當(dāng)增加劑量可提高纖維素酶活性，為正效應(yīng)因子。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及各因子對竹生薄孔菌纖維素酶活性的影響

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 最陡爬坡設(shè)計(jì) 由Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果可知，葡萄糖（X1）、麩皮（X3）、Tween 80（X4）和CoCl2（X7）這4個因子對竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶能力有顯著的影響，且其中葡萄糖（X1）為負(fù)效應(yīng)因子，麩皮（X3）、Tween 80（X4）和 CoCl2（X7）為正效應(yīng)因子，據(jù)此設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3?？梢钥吹?，第4組試驗(yàn)的纖維素酶活性最高，即當(dāng)葡萄糖（X1）、麩皮（X3）、Tween 80（X4）和 CoCl2（X7）分別為 7.0 g/L、35.0 g/L、10.0 mL/L和0.1 g/L時，竹生薄孔菌纖維素酶活性最高，為51.96 U/mL，故以第4組的條件作為Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì) Box-Behnken設(shè)計(jì)的編碼變量及水平取值、Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果列于表4?？梢姡?組試驗(yàn)的纖維素酶活性最高，即當(dāng)葡萄糖（X1）、麩皮（X3）、Tween 80（X4）和 CoCl2（X7）分別為5.0 g/L、35.0 g/L、9.0 mL/L和0.1 g/L時，竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶的能力最強(qiáng)，酶活為132.44 U/mL。各因子經(jīng)回歸擬合后，得到對編碼變量的二次多元回歸方程：

方差分析見表 5，F(xiàn)值為 203.31，P＜0.000 1，表明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度較高，可信度水平大于99.99%。判定系數(shù)R2為0.995 1，校正后的判定系數(shù)R2為0.990 2，說明只有0.98%的變化不能由該模型解釋。失擬項(xiàng)的F值為3.80，P值為0.104 9，不顯著，說明該模型不存在失擬因素。

如圖1，試驗(yàn)值與預(yù)測值分布的平價圖呈現(xiàn)一條直線，表明該模型預(yù)測值與試驗(yàn)值的差異很小，因此在可變化的范圍內(nèi)可用該模型指導(dǎo)試驗(yàn)。

此外，利用回歸方程分析結(jié)果繪制了竹生薄孔菌纖維素酶活性隨各因子變化的等高線圖和響應(yīng)曲面圖，見圖3。由表5中的各參數(shù)P值可知，一次 項(xiàng)X1、X3、X4和X7、 交 互 項(xiàng)X1X3、X1X4、X1X7、X3X4和X3X7、二次項(xiàng)、、和對響應(yīng)值Y的影響顯著（P＜ 0.05），而交互項(xiàng)X4X7的影響不顯著（P＞ 0.05）。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

由回歸方程得到竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)化液體培養(yǎng)基為：葡萄糖7.44 g/L、蛋白胨5.0 g/L、麩 皮 35.31 g/L、Tween 80 9.57 mL/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.06 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L、CaCl20.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.05 g/L、維生素B1 0.01 g/L，此時纖維素酶活性為52.65 U/mL。按此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，得到平均纖維素酶活性為53.17 U/mL，與上述預(yù)測值相近，比優(yōu)化前提高了2.84倍，表明回歸方程能夠真實(shí)地反映各因子對竹生薄孔菌纖維素酶活性的影響，證明應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化液體培養(yǎng)基以提高纖維素酶活性的方案切實(shí)可行，回歸方程準(zhǔn)確可靠。

3 討論

由于真菌所產(chǎn)纖維素酶多為胞外酶，種類豐富且易被提取、純化，更方便應(yīng)用于科學(xué)研究或商業(yè)化應(yīng)用，因而已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［42-43］。研究發(fā)現(xiàn)，不同真菌合成的纖維素酶其降解能力有顯著差異，且對環(huán)境的適應(yīng)能力也各不相同。賈翠英等［44］通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化了硬毛粗蓋孔菌（Funalia trogii（Berk.）Bondartsev & Singer） 的最適產(chǎn)纖維素酶條件：淀粉2%（質(zhì)量體積比）、酵母粉0.4%（質(zhì)量體積比）、干麩皮1.5%（質(zhì)量體積比 ）、KH2PO42.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.006 g/L，此時酶活為56.62 U/mL。Wang等［45］利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到瘤蓋擬層孔菌（Fomitopsis palustris（Berk. & M.A. Curtis）Gilb. &Ryvarden）產(chǎn)纖維素酶的最適培養(yǎng)基為麥麩2%（質(zhì)量 體 積 比 ）、（NH4）2SO40.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、尿素4.46 g/L、Tween 80 27.83 L/L，此時酶活可達(dá)到130.45 U/mL。李杏春等［46］通過測定野生大伏革菌（Phlebiopsis gigantea（Fr.）Jülich）菌株在最優(yōu)條件下所產(chǎn)纖維素酶的活力高低來達(dá)到篩選防治針葉樹根腐病高效菌株的目的，得到大伏革菌最適產(chǎn)纖維素酶條件為：葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨 5.0 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、裝液量120 mL/250 mL、接種量5%（體積比）、初始pH 4.0。

表4 各因子水平及Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計(jì)作為一種尋找多因子系統(tǒng)中最佳的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，通過綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析數(shù)據(jù)，建立多元二次回歸方程并擬合因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，以最經(jīng)濟(jì)的方式、較少的試驗(yàn)次數(shù)和較短的時間對所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究，能夠快速準(zhǔn)確地確定多因子系統(tǒng)的最優(yōu)條件，還可對實(shí)驗(yàn)中影響

響應(yīng)值的各因子及其交互作用進(jìn)行評價［45，47-48］。鑒于上述，響應(yīng)面設(shè)計(jì)目前已被廣泛應(yīng)用于各種條件優(yōu)化及模型的建立［49-52］。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)方差分析

圖2 竹生薄孔菌纖維素酶活性試驗(yàn)值與預(yù)測值分布的平價圖

圖3 葡萄糖、麩皮、Tween 80和CoCl2四因子的相互作用對竹生薄孔菌纖維素酶活性影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

本研究首先通過常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)確定了竹生薄孔菌纖維素酶的最佳收獲期是培養(yǎng)第10天；其次利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從11個培養(yǎng)基組分中篩選出葡萄糖、麩皮、Tween 80和CoCl2含量4個顯著因子，再進(jìn)行最陡爬坡設(shè)計(jì)得到Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)；最后通過Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶的液體培養(yǎng)基，將纖維素酶活性從最初的18.70 U/mL提高至53.17 U/mL，這些均為天然纖維素酶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，同時也說明響應(yīng)面設(shè)計(jì)對于尋找優(yōu)化方案確實(shí)是一種經(jīng)濟(jì)有效的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，可用于確定試驗(yàn)因素及其交互作用在工藝過程中對目標(biāo)響應(yīng)值的影響，精確地表達(dá)因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。其中，Plackett-Burman設(shè)計(jì)主要應(yīng)用于成分優(yōu)化及關(guān)鍵參數(shù)的篩選，通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，能夠從眾多因素中快速有效地篩選出主效因子，從而減少優(yōu)化過程中的考察因素?cái)?shù)和試驗(yàn)次數(shù)。最陡爬坡設(shè)計(jì)主要是在Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步逼近最優(yōu)區(qū)域，以結(jié)果最佳的組合確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。而Box-Behnken設(shè)計(jì)則是在上述二者設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，得到最優(yōu)組合。

4 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)、Box-Behnken設(shè)計(jì)得到褐腐真菌竹生薄孔菌產(chǎn)纖維素酶的最適液體培養(yǎng)基為：葡萄糖7.44 g/L、蛋白胨5.0 g/L、麩皮35.31 g/L、Tween 80 9.57 mL/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.06 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L、CaCl20.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.05 g/L、維生素B1 0.01 g/L，在此條件下得到纖維素酶活性為53.17 U/mL，與理論值52.65 U/mL相近，比優(yōu)化前提高了2.84倍。

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