伏貝貝 趙建志 李琛 劉新利 鮑曉明， 侯進

（1. 齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點實驗室，濟南 250000；2. 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250010）

萜類化合物是由異戊二烯五碳單元（C5）為基本碳骨架的一大類碳氫化合物，根據(jù)C5單元的數(shù)量和連接方式可將其分為單萜（C10）、倍半萜（C15）、雙萜（C20）、三萜（C30）、四萜（C40）、多萜等［1］。這些化合物種類繁多，功能多樣，廣泛分布于古細菌、細菌、植物、昆蟲中。研究較多的是倍半萜以及多萜類化合物在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，倍半萜青蒿素及衍生物較早就被用于治療瘧疾［2］；二萜紫杉醇更是具有抗多種腫瘤的神奇功效［3］；四萜番茄紅素具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病的作用［4］。單萜類化合物是植物精油的主要成分，除了常用于香料及食用香精、化妝品的合成，其在醫(yī)藥、化工領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用。例如，香葉醇常被用于香料及化妝品的生產(chǎn)，也可以作為臨床抗癌藥物、單萜吲哚生物堿類化合物（Monoterpene indole alkaloids）喜樹堿、長春新堿等的合成前體［5］。大部分單萜類化合物對細胞具有一定的毒性，故常用于抗菌劑和殺蟲劑的生產(chǎn)。近年來，單萜作為極具潛力的生物燃料，也越來越受到人們的重視。例如，香葉醇、檸檬烯和蒎烯二聚物具有較高的燃燒熱值，是航空燃料未來潛在的理想選擇［6-8］。

目前，單萜類化合物主要從植物中提取分離，但由于其產(chǎn)量低，成本高，生產(chǎn)周期長，且提取和純化比較困難，不利于大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。而化學(xué)合成面臨工序繁多且分離困難等問題，而且化學(xué)合成法很難實現(xiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜及有特定親和性和專一性的萜類化合物的合成。因此，隨著生物合成學(xué)的迅速發(fā)展，許多研究者通過基因工程、代謝工程和合成生物學(xué)手段，利用微生物合成萜類化合物，為萜類化合物的合成提供了清潔生產(chǎn)的新途徑［1］。釀酒酵母是一種最簡單的模式真核生物，具有生長速度快，對環(huán)境耐受性高，環(huán)境友好，遺傳操作技術(shù)成熟，且易于表達植物來源的P450單加氧酶等優(yōu)勢，是萜類化合物合成的理想的底盤細胞。目前，研究人員通過萜類合成途徑的引入和優(yōu)化、釀酒酵母前體代謝物合成的強化、全局代謝網(wǎng)絡(luò)工程化改造等策略，多種萜類化合物已經(jīng)在釀酒酵母中獲得了異源合成，有些化合物也獲得了接近產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)量。

1 釀酒酵母合成單萜的途徑基礎(chǔ)

所有萜類化合物都是由相應(yīng)的萜類合成酶經(jīng)過一系列的反應(yīng)催化共同前體異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和丙烯基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）合成的。自然界中存在合成萜類前體IPP和DMAPP的兩條途徑：一條是甲基赤蘚糖途徑（Methylerythritol-4-phosphate pathway），即MEP途徑，存在于植物、大多數(shù)細菌和原生動物體內(nèi)；另一條是甲羥戊酸途徑（Mevalonate pathway），即MVA 途徑［1］。除了存在于植物和少數(shù)細菌中外，還存在于古細菌和大多數(shù)的真核生物體內(nèi)［9］。目前研究較多的是MVA途徑，我們以釀酒酵母中的MVA途徑為例闡述單萜合成的途徑基礎(chǔ)。

如圖1所示，在釀酒酵母中，MVA途徑是細胞必需成分麥角固醇合成途徑的一部分，其起始反應(yīng)物為乙酰輔酶A。首先，乙酰輔酶A在乙酰乙酰輔酶A硫解酶（Acetoacetyl-CoA thiolase，Erg10）和羥甲基戊二酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase，Erg13）催化作用下形成甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMGCoA），接著HMG-CoA在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，Hmgr）催化作用下形成甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）［8］。研究表明，Hmg1是決定MVA途徑通量的關(guān)鍵限速酶。在酵母細胞中存在兩個Hmg同工酶，分別由HMG1和HMG2基因編碼。其中，有氧條件下Hmg1的酶活性占總還原活性的83%，而Hmg2僅占17%左右，且性質(zhì)不穩(wěn)定易降解［10］。甲羥戊酸接著在甲羥戊酸激酶（Mevalonate kinase，Erg12）催化作用下生成甲羥戊酸-5-磷酸，進一步在甲羥戊酸-5-磷酸激酶（Phosphomevalonate kinase，Erg8）催化下生成甲羥戊酸-5-焦磷酸，這兩步反應(yīng)是耗能過程，可消耗兩分子ATP。最后，甲羥戊酸-5-焦磷酸在脫羧酶（Mevalonate diphosphate decarboxylase，Erg19）催化作用下形成IPP，IPP經(jīng)異戊二烯基焦磷酸異構(gòu)酶（Isopentenyl diphosphate isomerase，Idi1）作用異構(gòu)化形成DMAPP［8］。在釀酒酵母中，法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl pyrophosphate synthetase，Erg20）催化一分子的IPP和一分子的DMAPP合成一分子的香葉基二磷酸（Geranyl diphosphate，GPP），即單萜類化合物的合成前體。通過相應(yīng)催化酶在GPP分子基礎(chǔ)上添加不同數(shù)量的IPP單元，形成其他萜類化合物的合成前體［11］。例如，倍半萜的前體法呢基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）、二萜的前體香葉基香葉醇焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate，GGPP）等。而FPP是甾醇和多萜醇等物質(zhì)合成的前體物質(zhì)，甾醇是真核細胞膜重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)控成分，其中麥角甾醇決定了生物膜流動性和滲透性［5］。

圖1 釀酒酵母單萜的生物合成途徑

2 釀酒酵母合成單萜的研究現(xiàn)狀

利用代謝工程及合成生物學(xué)等方法在微生物中重構(gòu)萜類合成途徑，通過優(yōu)化合成途徑使微生物成為高效合成萜類化合物的細胞工廠，已有不少文獻報道。在釀酒酵母中，很多萜類的合成已取得了較大的進展，產(chǎn)量達到了克級的水平，其中青蒿素前體紫穗槐二烯、β-胡蘿卜素的產(chǎn)量分別已經(jīng)達到40.0 g/L與2.1 g/L［12-13］。然而單萜的微生物合成發(fā)展仍然相對滯后，主要原因之一是前體GPP供給不足。不同于植物，釀酒酵母缺乏特異性的GPP合成酶，這是造成前體供給不足的主要原因。在釀酒酵母中，GPP和FPP的合成是由同一個酶法呢基焦磷酸合成酶Erg20連續(xù)催化生成的。在這一反應(yīng)過程中，GPP作為過渡中間產(chǎn)物，很少從Erg20催化位點上脫離，而是作為底物直接進行FPP的合成［14］。由于Erg20兼具GPP和FPP合成酶的雙重活性以及順序催化的特性，這就導(dǎo)致胞內(nèi)游離的前體GPP含量極低，這無疑成為構(gòu)建釀酒酵母單萜合成細胞工廠的障礙。

在植物中，單萜是由單萜合成酶催化前體GPP合成的。由于野生型的釀酒酵母中缺乏單萜合成酶，因此釀酒酵母細胞本身不具備合成單萜的能力，僅在少數(shù)葡萄酒酵母細胞內(nèi)非特異性磷酸酶的作用下產(chǎn)生極少量的萜類衍生物［15］。因此，構(gòu)建釀酒酵母單萜生物合成平臺的基本思路是：首先引入異源的單萜合成途徑；然后通過調(diào)控前體供給途徑增加前體供應(yīng)以進一步提高單萜的合成；最后綜合途徑改造達到產(chǎn)量優(yōu)化。

2.1 釀酒酵母中異源表達單萜合成途徑

在植物中，單萜由單萜合成酶催化前體GPP合成，外源單萜合成酶在釀酒酵母中功能性的表達是釀酒酵母單萜合成的重要前提。Oswald等［16］在釀酒酵母中表達了來源于Ocimum basilicum的香葉醇合成酶，得到了0.5 mg/L的香葉醇。Jongedijk等［17］在實驗室改造后的釀酒酵母中表達了來源于Perilla frutescens的（-）-檸檬烯合成酶和來源于Citrus limon的（+）-檸檬烯合成酶，其最佳產(chǎn)量達到0.49 mg/L和0.12 mg/L。Ignea等［18］篩選出兩株高產(chǎn)甾醇的野生型和實驗室釀酒酵母，并且表達了來源于Salvia fruticosa的桉樹腦合成酶基因（SfCinS1），構(gòu)建得到的重組釀酒酵母菌株，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)桉樹腦在兩個菌株中的產(chǎn)量分別達到了20 mg/L與7.5 mg/L，并且發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)甾醇的菌株中桉樹腦產(chǎn)量高。Herrero等［15］在釀酒酵母中表達來源于Clarkia breweri的芳樟醇合酶（Linalool synthases，LIS）基因，從而引入了芳樟醇合成代謝通路，構(gòu)建出了產(chǎn)芳樟醇的重組菌株，產(chǎn)量達到18 μg/L。異源表達酶活性的高低是產(chǎn)物合成效率高低的決定性因素。在利用微生物合成單萜的研究中，目前主要通過表達和分析不同來源的單萜合成酶，通過對目的產(chǎn)物產(chǎn)量的檢測，達到篩選出高活性合成酶的目的，然后通過去除導(dǎo)肽及蛋白質(zhì)工程等策略提高酶的催化效率。

本課題組前期比較了3種不同來源的香葉醇合成酶LdGES、ObGES和VoGES，發(fā)現(xiàn)表達來源于Valeriana officinalis的香葉醇合成酶VoGES獲得了更高的香葉醇產(chǎn)量［5］。隨后，Jiang等［19］比較了包括LdGES和VoGES在內(nèi)的9種不同來源的香葉醇合成酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達來源于Catharanthus roseus的香葉醇合成酶CrGES，香葉醇產(chǎn)量最高。由于單萜合成酶合成的時候都含有一個導(dǎo)肽，這些導(dǎo)肽的作用是把新合成的單萜合成酶定位到質(zhì)體中，之后這些導(dǎo)肽就被水解掉，然后這些蛋白就進一步加工成為有活性的酶。酵母不含有質(zhì)體，也不能水解去除這些導(dǎo)肽，所以合成的單萜合成酶的活性比較低。因此表達去除導(dǎo)肽的香葉醇合成酶會使其在酵母里有更高的活性［20-21］。Jongedijk等［17］研究表明，表達來源于P. frutescens和C. limon的檸檬烯合成酶PftLS和CltLS時，刪除導(dǎo)肽后檸檬烯的產(chǎn)量分別增加了約1.5倍和8.6倍。研究發(fā)現(xiàn)表達刪除導(dǎo)肽的tLdGES和tVoGES的重組菌株可產(chǎn)更高的香葉醇，香葉醇的產(chǎn)量分別增加了約7倍和3倍［5］。Jiang等［19］嘗試通過計算機模擬確定來源于C. roseus的香葉醇合成酶CrGES的最佳截短位置，并比較4個不同的截短位置（S14、L28、S43和S52）發(fā)現(xiàn)，4個截短的tCrGES均都能使香葉醇的產(chǎn)量得到不同程度的提高。其中，表達tS43CrGES的菌株中香葉醇的產(chǎn)量最高，達到191.61 mg/L，比對照菌株產(chǎn)量提高了43倍。為進一步闡明導(dǎo)肽位置效應(yīng)如何影響酶活性的機制，該團隊通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行同源模建分析發(fā)現(xiàn)，tS43CrGES蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這也說明穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是影響酶活的重要因素。

雖然提高單萜合成酶的活性在一定程度上可提高單萜化合物的產(chǎn)量，但單純單萜合成酶的表達，僅能使微生物獲得單萜合成的能力。為了進一步提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量，還需要對微生物內(nèi)源代謝途徑進行合理的調(diào)控優(yōu)化，提高前體的合成效率。

2.2 釀酒酵母中增加單萜前體的合成通量提高單萜產(chǎn)量

在植物中，單萜主要在質(zhì)體中合成，由單萜合成酶催化前體GPP合成單萜。而GPP由專一性GPP合成酶催化IPP和DMAPP合成。但是釀酒酵母通過MVA途徑僅能釋放很少的單萜的合成前體物質(zhì)GPP，酵母缺乏特異性的GPP合成酶，導(dǎo)致釀酒酵母中GPP的含量遠低于FPP，大大限制了單萜的產(chǎn)量［14］。為了增加GPP的合成，研究人員嘗試了多種策略，包括增強MVA途徑的通量、動態(tài)截流GPP下游代謝途徑以及GPP合成酶的蛋白質(zhì)工程等。

增強MVA途徑的通量一般通過MVA途徑中關(guān)鍵限速酶的表達實現(xiàn)。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（Hmgr）是甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵限速酶，催化HMG-CoA生成甲羥戊酸。酵母本身的Hmgr是由錨定結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域兩部分組成，其表達受到嚴格的調(diào)控。Donald等［22］研究發(fā)現(xiàn)刪除Hmgr的錨定結(jié)構(gòu)域后，Hmgr的mRNA水平顯著提高，且酶活性和下游代謝產(chǎn)物鯊烯的含量也得到了明顯的增加，這說明錨定跨膜結(jié)構(gòu)域的刪除一定程度上解除了Hmgr的調(diào)控，更利于提高MVA途徑的通量。Keasling等［23］在釀酒酵母細胞中構(gòu)建表達青蒿素前體青蒿二烯合成酶（ADS）基因后，通過過表達Hmgr的催化結(jié)構(gòu)域（Truncated HMG-CoA reductase，tHmgr），解除甲羥戊酸途徑中的內(nèi)源限速步驟，使倍半萜青蒿二烯產(chǎn)量提高了5倍。Liu等［24］利用同樣的方法過表達tHmgr，使得單萜香葉醇的產(chǎn)量提高到1.57 mg/L。Rico等［25］通過提高tHMG1基因表達水平，使芳樟醇產(chǎn)量從 21.92 μg/L提高至30.19 μg/L。除了Hmgr，異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（Idi1）催化 IPP和DMAPP之間的異構(gòu)化，也是實現(xiàn) GPP合成的重要步驟。該反應(yīng)雖為可逆反應(yīng)，但Idi1表達較低，IPP的含量遠高于DMAPP，通過提高Idi1的表達量改變胞內(nèi)IPP和DMAPP的比例也是實現(xiàn)重新分配GPP和FPP合成的重要步驟［5］。Ignea等［26］在釀酒酵母中過表達Idi1使單萜檜烯產(chǎn)量提高了3倍。此外，Upc2是調(diào)控釀酒酵母細胞內(nèi)甾醇生物合成的全局轉(zhuǎn)錄因子，研究表明其突變體Upc2-1（G888D）能夠增強甾醇途徑的合成［27］?；诖搜芯拷Y(jié)果，我們在釀酒酵母中過表達Upc2-1后，香葉醇的產(chǎn)量提高了 32%［5］。

MVA合成途徑的強化是提高包括單萜在內(nèi)的萜類化合物合成的通用策略，然而這些策略雖然可以提高單萜的合成，但增加的代謝流大部分流向了FPP下游產(chǎn)物，而非用于單萜的合成，因此特異性GPP合成酶的引入及蛋白質(zhì)工程改造就顯得尤為重要。Ignea等［26］表達了Picea abies來源的GPP合成酶，使檜萜產(chǎn)量提高30%-40%。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在酵母中引入來源于Abies grandis、P. abies、C. roseus的去除質(zhì)體導(dǎo)肽的GPP合成酶tAgPPS2、tPaPPS2和tCrGPPS，香葉醇合成不但沒有提高，反而有所下降［5］。推測異源GPP合成酶可能難以在釀酒酵母中實現(xiàn)活性表達。因此，內(nèi)源FPP合成酶Erg20的蛋白質(zhì)工程改造，成為提高GPP合成的主要策略。Fischer等［14］對釀酒酵母內(nèi)源FPP合成酶Erg20進行同源模建，發(fā)現(xiàn)第197位的賴氨酸（Lys）是關(guān)鍵活性位點，并對該位點進行了一系列的定點突變，通過香葉醇的合成作為GPP合成的檢測指標發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Lys突變?yōu)楦拾彼幔℅ly）、丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、半胱氨酸（Cys）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）后，產(chǎn)量提高約10-20倍。此外，突變菌株產(chǎn)香葉醇、芳樟醇、香茅醇都有了不同程度的提高?；贔isher等的研究，Ignea等［26］對Erg20通過蛋白結(jié)構(gòu)模建分析，得到了阻礙FPP合成酶的活性的關(guān)鍵位點F96、A99、N127，然后對其做了一系列的突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別表達突變的 Erg20（F96W）、Erg20（N127W）后，檜萜的產(chǎn)量分別提高了3.21和5.57倍。而F96W和N127W雙點突變使檜萜產(chǎn)量增加到10.32倍。Kühner等和 Menon等［28-29］的研究發(fā)現(xiàn)，在代謝途徑中，參與連續(xù)催化的酶的活性中心相互靠近可減少中間產(chǎn)物的釋放，有利于對底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。因此，作者前期在Erg20（F96W-N127W）和來源于V.officinalis的去除導(dǎo)肽序列的香葉醇合成酶tVoGES之間引入不同的連接肽，對Erg20WW和tVoGES做了一系列的融合發(fā)現(xiàn)，相對于沒有融合的Erg20WW和tVoGES，表達融合后的tVoGES-GGGS-Erg20WW使得香葉醇的產(chǎn)量提高了1.7倍［5］。Jiang等［19］也采用相似的策略，融合Erg20（F96W-N127W）和t3CrGES后，提高了香葉醇的產(chǎn)量。Deng等［30］在釀酒酵母中表達了來源于Actinidia arguta的芳樟醇合成酶（AaLS1），然后用3個不同長度的連接肽將芳樟醇合成酶（AaLS1）與法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthetase，F(xiàn)PPS）進行融合，結(jié)果表明（GGGGS）3更有助于兩個酶酶活中心的靠近，從而促進了芳樟醇的產(chǎn)生，相比于共表達AaLS1和FPPS的重組菌株，產(chǎn)量提高了69.7%。

2.3 減少單萜內(nèi)源性轉(zhuǎn)化提高單萜產(chǎn)量

在萜類化合物合成過程中，前體及萜類化合物本身在細胞內(nèi)的非特異性轉(zhuǎn)化或者進一步代謝往往是造成產(chǎn)量降低的重要原因。尤其在發(fā)酵后期，細胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化、營養(yǎng)成分缺乏、次級代謝反應(yīng)活躍，增大了萜類物質(zhì)發(fā)生內(nèi)源性轉(zhuǎn)化的機率。研究表明，生物體內(nèi)的GPP和FPP可以在非特異性的磷酸酶和脫氫酶作用下發(fā)生內(nèi)源性轉(zhuǎn)化，生成某些萜類化合物［31］。另外，一些萜類化合物也可在非特異性反應(yīng)的作用下異構(gòu)化，形成不同類型的同分異構(gòu)體。以單萜香葉醇為例，在芳香類植物中，香葉醇可以轉(zhuǎn)化成其他萜類化合物，賦予植物不同的怡人香氣。雖然野生型釀酒酵母合成萜類化合物的能力非常弱，但是某些葡萄酒酵母可以通過細胞內(nèi)的水解酶或者脫氫酶非特異性的轉(zhuǎn)化萜類化合物［32-33］。在釀酒酵母中，老黃酶（Old yellow enzyme，OYE）家族是細胞響應(yīng)外源毒性物質(zhì)解毒過程中的重要酶類，可將香葉醇轉(zhuǎn)化為其同分異構(gòu)體香茅醇。Steyer等［34］在釀酒酵母的培養(yǎng)基中添加一定量的香葉醇，經(jīng)檢測除了香葉醇之外，還產(chǎn)生了香葉乙酸酯、香茅醇、橙花醇乙酸酯，并發(fā)現(xiàn)Oye2是催化將香葉醇轉(zhuǎn)化成香茅醇的主要還原酶。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中敲除OYE2，分批發(fā)酵中香葉醇產(chǎn)量提高1.7倍［31］。ATF1和ATF2編碼的乙酰基轉(zhuǎn)移酶參與了萜烯醇的乙?；軌?qū)⑾闳~醇轉(zhuǎn)化成萜烯乙酸酯。添加一定量的香葉醇的條件下，進行發(fā)酵實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除ATF1以及ATF2，萜烯乙酸酯分別降低了31%、66%-88%［34］。基于Steyer等的研究基礎(chǔ)上，我們在釀酒酵母中敲除ATF1，分批發(fā)酵中香葉醇產(chǎn)量提高了1.6倍［31］。在大腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的單萜內(nèi)源性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，Zhou等［35］在大腸桿菌中構(gòu)建了香葉醇合成的重組菌株，在發(fā)酵實驗中發(fā)現(xiàn)，香葉醇產(chǎn)量達到最高后會發(fā)生下降，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)香葉醇被內(nèi)源脫氫及異構(gòu)化為橙花醇、橙花醛、香葉醛。同時他們發(fā)現(xiàn)YjgB是參與香葉醇內(nèi)源性轉(zhuǎn)化為香葉的主要酶，與出發(fā)菌株相比，敲除YJGB的菌株，香葉醇的產(chǎn)量提高了24%。

2.4 減少單萜對細胞的毒害作用有助于增強微生物單萜合成效率

單萜對微生物細胞具有較強的毒性，因此常常作為抑菌劑。有研究表明，單萜對細胞造成毒性的原因可能有以下幾個方面：（1）破壞細胞膜功能，導(dǎo)致菌體死亡。Liu等［36］用致死劑量的檸檬烯脅迫釀酒酵母細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞膜功能受到嚴重的損傷，其流動性降低、通透性增高以及脂肪酸的比例增加。（2）破壞細胞壁的完整性，抑制菌體生長。Brennan等［37］的研究表明，檸檬烯可以改變細胞壁的結(jié)構(gòu)和功能，對細胞分裂有明顯的抑制作用。他們通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，麥角固醇和脂肪酸生物合成途徑相關(guān)的基因并沒有上調(diào)，而與細胞壁完整性相關(guān)的基因上調(diào)，同時還發(fā)現(xiàn)檸檬烯處理后的細胞對細胞壁降解酶的敏感性增加4倍。目前對于單萜破壞細胞壁與細胞膜的具體機理研究仍然不清楚。（3）誘發(fā)細胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，進而破壞包括細胞膜在內(nèi)的多個細胞器膜的功能。Bakkali等［38］研究發(fā)現(xiàn)不同單萜處理釀酒酵母能夠誘發(fā)不同種類的ROS的積累。（4）影響胞內(nèi)能量代謝。Uribe等［39］發(fā)現(xiàn)β-蒎烯能夠抑制細胞呼吸，影響了H+和K+在酵母細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，干擾線粒體膜的完整性和ATP的生成。

由以上單萜對細胞毒性的機制可以看出，當(dāng)單萜的濃度達到一定數(shù)值時，其對細胞可能會造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，抑制菌體的生長，甚至導(dǎo)致菌體的死亡。因此，減少單萜對釀酒酵母的毒害作用是提高利用釀酒酵母高效生產(chǎn)單萜的重要因素。目前主要通過兩種途徑減輕單萜對細胞的毒害作用：一是提高細胞自身的單萜耐受性；二是減少單萜與細胞的接觸。2012年，Brennan等［7］的研究表明，當(dāng)檸檬烯達到60 mg/L時，釀酒酵母會停止生長。2015年，該團隊通過逐步提高檸檬烯的脅迫濃度對釀酒酵母進行適應(yīng)性進化經(jīng)過200次傳代培養(yǎng)，篩選獲得六株檸檬烯耐受性明顯提高的菌株，并進行基因組全測序，分析鑒定了關(guān)鍵突變蛋白tTcb3p1-989。他們隨后對該蛋白進行了功能性和普適性驗證，發(fā)現(xiàn)過表達tTcb3p1-989能夠使進化前的菌株對檸檬烯的耐受性提高了9倍，同時發(fā)現(xiàn)tTcb3p1-989對β-蒎烯、月桂烯和生物噴墨燃料混合物AMJ-700t（10%甲基異丙基苯，50%檸檬烯，40%法呢烯）的耐受性也有明顯的提高，這說明tTcb3p1-989對提高釀酒酵母單萜耐受性具有一定的普適性［40］。

減少單萜和細胞的接觸也是緩解毒性的一種有效策略，主要包括單萜的外排和隔離兩種方式，該策略對于不同的菌具有一定的普適性。單萜主要是通過自由擴散或者相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白通過主動運輸實現(xiàn)從胞內(nèi)到胞外的外排。Dunlop等［41］從細菌基因組中篩選出了不同的外排泵，并將其中的43個在大腸桿菌中進行了異源表達，發(fā)現(xiàn)表達來源于大腸桿菌外排泵AcrAB和來源于Alcanivorax borkumensis的未鑒定的外排泵均可使大腸桿菌對檸檬烯的耐受性增加。相似的，Wang等［42］將來源于子囊菌Grosmannia clavigera的 ABC轉(zhuǎn)運蛋白 GcABC-G1，在釀酒酵母中進行異源表達，然后用不同單萜對細胞進行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)GcABC-G1明顯提高了重組酵母菌株的存活率。在大規(guī)模的微生物工業(yè)化生產(chǎn)過程中，生物反應(yīng)器中的菌體密度和產(chǎn)物濃度較高，這就大大增加了產(chǎn)物和細胞的接觸機會。對于具有揮發(fā)性和毒性的產(chǎn)品來說，往往采取兩相發(fā)酵的方式，即在生產(chǎn)過程中添加對細胞無毒的有機溶劑，及時萃取產(chǎn)物，這種方式不但防止了產(chǎn)物揮發(fā)，而且有效的降低了目的產(chǎn)物對細胞的毒性。在萜類生產(chǎn)過程中，目前普遍采用的兩種比較理想的有機相，分別是十二烷和肉豆蔻酸異丙酯［17，19］。

雖然目前研究不同程度的提高了釀酒酵母對單萜的耐受性，但總體而言，單萜的毒性仍然是限制其高產(chǎn)的一個重要因素。因此，解析單萜造成毒性的關(guān)鍵機理并進一步提高釀酒酵母的單萜耐受性，可以為通過代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效的釀酒酵母合成單萜平臺奠定基礎(chǔ)。

2.5 單萜合成的產(chǎn)量總結(jié)

目前，通過代謝工程改造釀酒酵母可以實現(xiàn)多種單萜的生物合成，主要包括檸檬烯、香葉醇、芳樟醇、檜萜和桉樹腦等。另外，單萜吲哚生物堿類化合物是一類重要的臨床抗腫瘤藥物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成途徑涉及十步以上的催化反應(yīng)，尤其是特異性的P450酶參與的氧化反應(yīng)，更是該類化合物合成的關(guān)鍵。作為P450酶表達的優(yōu)良宿主細胞，在釀酒酵母中以香葉醇為前體，成功合成了單萜吲哚生物堿類化合物strictosidine［43］。表1總結(jié)了釀酒酵母中單萜合成的產(chǎn)量水平以及采取的途徑改造策略。

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，大部分單萜產(chǎn)量處于毫克級水平，說明利用微生物生產(chǎn)單萜有著較大的提升空間，但是如何實現(xiàn)單萜的高效生物合成依然面臨諸多的挑戰(zhàn)。

表1 釀酒酵母中單萜及其衍生物的產(chǎn)量和相關(guān)的途徑改造策略

3 展望

作為極具潛力的微生物細胞工廠，釀酒酵母在合成萜類化合物研究中呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。釀酒酵母除了具有較強的魯棒性外，其細胞內(nèi)環(huán)境更接近于植物細胞內(nèi)環(huán)境，更有利于表達植物來源的酶類的表達，尤其P450氧化酶等。目前，相比于倍半萜，單萜的微生物合成研究起步較晚，發(fā)展相對滯后。雖然通過各種各樣的代謝工程和合成生物學(xué)的方法，包括高活性異源酶類的直接篩選、蛋白質(zhì)的理性設(shè)計、增強前體合成途徑的通量以及模塊化工程等，使單萜的產(chǎn)量得到了較大的提高，但是離工業(yè)化的生產(chǎn)差距還較遠，仍有許多工作需要進一步完善。

為進一步提高釀酒酵母中單萜的合成能力，并結(jié)合當(dāng)前研究中遇到的困難，我們認為未來工作可重點從以下幾個方面開展研究：（1）采用動態(tài)調(diào)控等策略進一步合理弱化下游途徑。通過動態(tài)調(diào)控，可減少代謝中間產(chǎn)物的積累，減少額外的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，從而更有利于目的產(chǎn)物的合成。例如，應(yīng)用能夠響應(yīng)代謝產(chǎn)物或者培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)成分的啟動子，如碳源響應(yīng)的啟動子調(diào)控代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達，使菌體生長階段和產(chǎn)物產(chǎn)生階段有效的分離，這樣不僅避免了產(chǎn)物過早合成抑制菌體生長的問題，而且可以實現(xiàn)產(chǎn)物的集中合成，更利于碳源的有效分配。（2）加強前體乙酰輔酶A的合成，并增加乙酰輔酶A到MVA途徑的通量。為了提高倍半萜的產(chǎn)量，研究者深入了解乙酰輔酶A在釀酒酵母中的代謝過程，并改造其合成途徑，敲除消耗乙酰輔酶 A的反應(yīng)，使乙酰輔酶A 更多的流向細胞質(zhì)。例如，改造后的菌株使倍半萜紫穗槐二烯和α-檀香萜烯產(chǎn)量明顯提高［46-47］。而在單萜合成中，對其合成前體乙酰輔酶A的途徑改造研究設(shè)計較少。（3）通過理性的膜工程設(shè)計增強細胞膜的修復(fù)和再生能力，提高釀酒酵母對單萜的耐受性，構(gòu)建具備更高耐受性的釀酒酵母菌株。釀酒酵母體內(nèi)編碼磷脂和細胞膜合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平在單萜脅迫條件下顯著提高，表明細胞膜修復(fù)能力對提高釀酒酵母單萜耐受性具有重要意義［48］。因此可通過改變細胞膜中磷脂比例及其分子排列方式等提高釀酒酵母的單萜耐受性。（4）通過結(jié)合計算機模擬的策略對代謝網(wǎng)絡(luò)進行分析、采用多變量的模塊優(yōu)化技術(shù)等對參與萜類合成的途徑進行改造，從而達到優(yōu)化代謝流向、提高單萜合成的目的。

全球資源越來越匱乏、環(huán)境惡化等問題的日益嚴重，滿足人類對能源和健康的需求，構(gòu)建高效的微生物細胞工廠將生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成各種終端產(chǎn)品已成為必然的趨勢。隨著合成生物學(xué)的高速發(fā)展，利用合成生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)加速了細胞工廠的構(gòu)建和優(yōu)化，也必將縮短從設(shè)計到產(chǎn)業(yè)化的距離。隨著一些限制性因素的突破，利用微生物合成單萜的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)必將為人類的可持續(xù)發(fā)展作出貢獻。

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