胡孟娟，周麗娜，牛延萍，徐立新，宋小凱，李祥瑞，嚴若峰

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生于牛、羊、駱駝等反芻動物皺胃，吸食宿主血液，繁殖力高，流行廣泛，致病性強[1]。宿主感染該病原易引起嚴重胃炎、貧血、腹瀉等[2]，大量感染致使幼齡動物死亡，對全世界畜牧業(yè)產(chǎn)生巨大威脅，并造成嚴重經(jīng)濟損失[3]。因此，研究并開發(fā)出一種有效的疫苗來防治該病尤為重要。隨著各方面研究的深入，人們逐步認識到，要想研制有效的疫苗，必須深入了解捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生過程中的一些重要問題，包括線蟲侵入宿主機制、消化道附著機制、吸血機制和免疫抑制機制等[4]。

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease，CP)是一類重要的細胞內(nèi)蛋白酶，在生物進化過程中非常保守，其活性中心含有半胱氨酸殘基，廣泛存在于各種生物體中[5]。近年來對寄生蟲半胱氨酸蛋白酶研究頗多，如弓形蟲、旋毛蟲、肝片吸蟲等，研究發(fā)現(xiàn)該酶參與寄生蟲攝取營養(yǎng)、免疫逃避、在宿主體內(nèi)移行等過程，是一種良好的疫苗候選抗原。利用Race技術克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶(Hc58)，并對其序列和蛋白質(zhì)功能進行分析，結果表明該基因全長序列為851 bp，編碼217個氨基酸，該蛋白質(zhì)屬于木瓜蛋白酶類的C1族組織蛋白酶B樣蛋白酶，可能在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的食血過程和在宿主體內(nèi)存活起到重要作用[6]。同時構建了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc58 DNA疫苗，并進行了山羊免疫保護性試驗，研究發(fā)現(xiàn)每克糞便蟲卵數(shù)、蟲卵孵化率和皺胃荷蟲數(shù)比對照組分別減少了28.02%、47.6%和28.3%，結果表明Hc58 DNA疫苗具有較好的免疫保護效果[7]。本試驗通過體外試驗分析Hc58對山羊PBMCs的影響，結果對了解該蛋白質(zhì)誘導宿主免疫保護機制具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 3～6月齡健康山羊，購自南京某郊區(qū)養(yǎng)殖場。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 pET-28a-Hc58質(zhì)粒，大腸桿菌BL21均由本實驗室保存。

1.1.3 主要工具酶和試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司；Pierce?BCA Protein Assay Kit蛋白定量分析試劑盒購于美國 Thermo公司；淋巴細胞分離液為天津灝洋生物公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基及胰酶消化液均購于Gbico公司；胎牛血清購自Life technologies公司；12孔、24孔、96孔Costar?細胞培養(yǎng)板購自Corning公司；E.Z.N.ATMTotal RNA kit I為OMEGA公司產(chǎn)品；總一氧化氮檢測試劑盒購自碧云天公司；Millcell?Hanging Cell Culture Inserts購自Merck-Millipore公司；HiScriptTMQ RT SuperMix for qPCR試劑盒、ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix均購于南京諾唯贊公司；Annexin V-FITC Kit購自南京福麥斯生物公司；FITC-dextran為美國Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器與設備 ImageQuant300凝膠成像分析系統(tǒng)(美國GE公司)，5417R冷凍臺式離心機(德國Eppendorf公司)，Thermo Scientific 8000 CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，ABI7500熒光定量PCR儀，PCR擴增儀(日本TaKaRa)，BD FACSCalibur 流式細胞儀(美國Bectom Dickinson公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的鑒定與表達 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，隨機挑取單菌落，提取質(zhì)粒用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送去南京擎科生物公司進行測序。將測序正確的菌液接種于含1 μg·mL-1Kana抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，次日以1∶100接種于1 000 mL液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫搖床180 r·min-1搖至OD600 nm值為0.4～0.6，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol·L-1繼續(xù)誘導5 h。收集菌體，超聲破碎，SDS-PAGE檢測菌體分布在上清或包涵體。

1.2.2 重組蛋白質(zhì)的純化 參照說明書使用鎳柱吸附蛋白質(zhì)原理對重組蛋白質(zhì)進行純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測后，將重組蛋白質(zhì)放入含梯度濃度尿素的復性緩沖液中分別復性透析8 h，經(jīng)聚乙二醇濃縮后，測定濃度，過濾除菌分裝凍存。

1.2.3 山羊PBMCs和單核細胞的分離與培養(yǎng) 從健康山羊頸靜脈中無菌采取抗凝血，參照淋巴細胞分離液說明書分離PBMCs。臺盼藍染色觀察活細胞在95%以上。將收集的PBMCs用含1%的雙抗和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液吹懸混勻，調(diào)整細胞濃度為1×106·mL-1。單核細胞具有貼壁生長的特性，由此可進行分離。將分離的PBMCs或單核細胞與終質(zhì)量濃度為0、10、20、40 μg·mL-1的重組蛋白質(zhì)Hc58共孵育，置于37 ℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 重組蛋白質(zhì)對單核細胞分泌一氧化氮的影響 取“1.2.3”處理好的單核細胞懸液，每孔1 mL，分別加入24孔板中，并設置pET-28a標簽蛋白對照組，每組三個重復。培養(yǎng)24 h后，離心取細胞上清，按照碧云天總NO檢測說明書進行測定。

1.2.5 重組蛋白質(zhì)對山羊單核細胞吞噬能力的影響 將“1.2.3”處理好的單核細胞接種于24孔板中，每孔1 mL，同時設置pET-28a標簽蛋白對照組，每組三個重復。培養(yǎng)48 h后，收集細胞，每管加入1 mL預冷的PBS溶液洗滌，用100 μL PBS溶液重懸細胞，再加入100 μL異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC-dextran)，混勻，分別置于4和37 ℃避光孵育1 h；用預冷的含2% FBS的PBS溶液洗滌，再用500 μL PBS溶液重懸細胞；轉(zhuǎn)入流式管中，上流式細胞儀進行檢測。參照文獻[8]細胞吞噬指數(shù)(cell phagocytosis index，PI)計算公式PI=MFI試驗組/MFI細胞對照組對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

1.2.6 重組蛋白質(zhì)對PBMCs分泌細胞因子的影響 取24孔板，每孔1 mL加入“1.2.3”處理好的PBMCs細胞懸液，設置pET-28a標簽蛋白對照組，每組三個重復。培養(yǎng)24 h后，參照總RNA提取試劑盒說明書對細胞RNA進行提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照文獻[9]設計并合成山羊細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β的引物，以β-actin為內(nèi)參，采用熒光定量PCR對山羊PBMCs細胞因子轉(zhuǎn)錄水平進行測定。

1.2.7 重組蛋白質(zhì)對PBMCs遷移的影響 取24孔板，每孔加入“1.2.3”處理好的PBMCs細胞懸液1 mL，同時設置pET-28a標簽蛋白對照組，每組三個重復，培養(yǎng)24 h后，進行細胞計數(shù)；再嵌入遷移小室，培養(yǎng)2 h后，收集遷移至下室的細胞，經(jīng)過計數(shù)，算出細胞的遷移率。

1.2.8 重組蛋白質(zhì)對PBMCs凋亡的影響 于24孔板中分別加入“1.2.3”處理好的PBMCs細胞懸液1 mL，并設置pET-28a標簽蛋白對照組，每組三個重復。培養(yǎng)48 h后，收集細胞于1.5 mL Eppendorf管中，500 g離心5 min，棄上清；用預冷的1×Binding Buffer洗滌兩遍；100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞；再加入10 μL Annexin V-FITC；輕輕吹打混勻，避光孵育15 min；再用1×Binding Buffer洗滌兩遍，棄上清，加入500 μL 1×Binding Buffer和5 μL碘化丙啶(propidium iodide)，輕輕混勻，轉(zhuǎn)入流式管，上機檢測細胞凋亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結 果

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc58的鑒定表達與純化

重組原核表達質(zhì)粒pET-28a-Hc58經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切鑒定，顯示有一條載體條帶和一條850 bp左右的目的片段，結果與預測相符。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行誘導表達，重組蛋白主要以包涵體的形式存在，獲得的融合蛋白相對分子質(zhì)量約為27 ku(圖1)。

2.2 重組蛋白質(zhì)對山羊單核細胞分泌NO的影響

單核細胞與不同濃度的重組蛋白Hc58作用后，在質(zhì)量濃度為20和40 μg·mL-1時，能顯著(P<0.01或P<0.001)增強單核細胞分泌NO，而在質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1時，影響不明顯(圖2)。本研究中，pET-28a標簽蛋白對照組與細胞對照組無顯著差異，說明融合蛋白質(zhì)中標簽蛋白對試驗無影響。

2.3 重組蛋白質(zhì)對山羊單核細胞吞噬能力的影響

與細胞對照組相比，試驗組中3種質(zhì)量濃度的重組蛋白質(zhì)Hc58均能顯著(P<0.01或P<0.001)促進山羊單核細胞的吞噬能力(圖3)。

2.4 重組蛋白質(zhì)對山羊PBMCs分泌細胞因子的影響

重組蛋白質(zhì)Hc58刺激PBMCs后，3個試驗組中，IL-2、IL-4、IL-17轉(zhuǎn)錄量均顯著(P<0.01或P<0.001)高于細胞對照組；當?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度為10和20 μg·mL-1時， IFN-γ轉(zhuǎn)錄量極顯著(P<0.001)高于細胞對照組，而IL-10、TGF-β變化不明顯(圖4)。

2.5 重組蛋白質(zhì)對山羊PBMCs遷移能力的影響

試驗結果顯示，3種濃度的重組蛋白質(zhì)Hc58與PBMCs作用后，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20和40 μg·mL-1時，能顯著(P<0.01或P<0.001)促進山羊PBMCs的遷移，作用效果隨著Hc58的濃度增加而增強(圖5)。

2.6 重組蛋白質(zhì)對山羊PBMCs凋亡的影響

本試驗中，PBMCs經(jīng)不同濃度的Hc58作用后，細胞凋亡的比例呈劑量依賴性。其中，20和40 μg·mL-1的重組蛋白質(zhì)能極顯著的促進細胞凋亡(P<0.001)(圖6、圖7)。

A.重組質(zhì)粒pET-28a-Hc58的雙酶切鑒定(M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1.pET-28a-Hc58經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ的酶切產(chǎn)物)；B.重組蛋白Hc58的分布(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.表達產(chǎn)物上清；2.表達產(chǎn)物沉淀)；C.重組蛋白Hc58的純化(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.純化前包涵體蛋白；2.純化后包涵體蛋白)A. Identification of recombinant plasmid pET-28a-Hc58 by restriction enzyme digestion (M. DNA marker; 1.pET-28a-Hc58 digested by BamHⅠand Hind Ⅲ); B. Distribution of recombinant Hc58 (M. Protein marker; 1.Supernatant of expression products; 2.Precipitate of expression productions); C. Purification of recombinant Hc58(M.Protein marker; 1.Inclusion body without purification; 2.Purified protein from inclusion body)圖1 Hc58基因的鑒定表達與蛋白質(zhì)純化Fig.1 Identification, expression and purification of recombinant Hc58

與細胞對照組(0 μg·mL-1)相比，**.P<0.01；***.P<0.001。下圖同Compared with the control group (0 μg·mL-1),**.P<0.01; ***.P<0.001. The same as follow圖2 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊單核細胞分泌NO的影響Fig.2 Effect of recombinant Hc58 on the NO production of goat monocytes

圖3 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊單核細胞吞噬功能的影響Fig.3 Effect of recombinant Hc58 on the phagocytosis of goat monocytes

3 討 論

尋找具有免疫保護效果的蟲體抗原是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗研究的一個重要方向。研究發(fā)現(xiàn)一些膜內(nèi)分泌蛋白，尤其是酶類，不僅具有很強的抗原性，而且在同一蟲體的不同發(fā)育時期均有分泌，參與蟲體的入侵、吸附、繁殖、免疫逃避等過程，并在寄生蟲與宿主之間的相互作用中扮演重要角色[10]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶Hc58分布于腸微絨毛表面，具有血凝活性，可降解山羊血紅蛋白、IgG和纖維蛋白原，具有顯著的免疫原性[11]。

圖4 重組蛋白質(zhì)Hc58影響山羊PBMCs多種細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄情況Fig.4 The mRNA transcriptional level of multiple cytokines in PBMCs of goat stimulated by recombinant Hc58

圖5 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊PBMCs遷移的影響Fig.5 Effect of recombinant Hc58 on the migration of goat PBMCs

外周血單個核細胞(PBMCs)指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞等，是免疫系統(tǒng)功能研究的重要成分[12]。筆者從細胞吞噬、遷移等幾個方面進一步研究重組蛋白Hc58對PBMCs免疫功能的影響，為闡釋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲與宿主之間的免疫機制奠定基礎。

NO是體內(nèi)重要的信使分子，參與細胞殺傷、內(nèi)分泌激素的釋放等過程，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[13]。研究表明，NO在機體抵抗錐蟲、瘧原蟲、血吸蟲、利什曼原蟲等大多數(shù)寄生蟲感染過程中發(fā)揮重要作用[14]。吳玲燕等[12]研究表明，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組蛋白NDUDC刺激山羊PBMCs能夠促進NO的分泌，且呈劑量依賴性。而本試驗中，20和40 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)Hc58刺激單核細胞后，也能顯著促進單核細胞釋放NO。而且單核細胞或巨噬細胞被活化后，吞噬能力增強，能清除體內(nèi)病原體和損傷的細胞[15]。本試驗發(fā)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)Hc58能顯著增強單核細胞的吞噬功能，加強了機體的防御能力。

Th1、Th2類免疫和炎癥反應分泌的細胞因子在抵抗寄生蟲感染中起重要的作用[16]。IL-2和IFN-γ由Th1類細胞分泌，IL-4由Th2類細胞分泌。IL-2可刺激T細胞增殖而增強細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞的活性。IFN-γ可刺激巨噬細胞活化，增強其抗原提呈能力。IL-4可促進B細胞的生長增殖及分泌IgE抗體[17]。IL-17由Th17類細胞分泌，主要是在機體受到真菌或其他外源物質(zhì)攻擊時通過在感染部位募集中性粒細胞發(fā)揮作用[18]。而IL-10和TGF-β則由Treg細胞分泌，TGF-β則可能是機體關閉免疫應答的信號，對各類免疫細胞均具有抑制作用[19]。Y. L. Wen等[15]和M. Ehsan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組蛋白Miro-1、精氨酸激酶可通過Th1、Th2和Th17來調(diào)節(jié)寄生蟲與宿主之間的免疫應答，其中Th2類免疫占主導作用。而本試驗中IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-17轉(zhuǎn)錄水平變化明顯，IL-10、TGF-β變化不明顯，且20 μg·mL-1重組蛋白Hc58試驗組IL-2、IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.001)，變化最為明顯，表明Hc58可誘導Th1、Th2、Th17類細胞分泌細胞因子調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，且主要誘導Th1類免疫反應。

圖6 雙染流式分析Fig.6 The flow cytometry picture showed double staining by Annexin V-FITC and Propidium iodide

圖7 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊PBMCs凋亡的影響Fig.7 Effect of recombinant Hc58 on the apoptosis of goat PBMCs

細胞遷移是機體正常發(fā)育和生理活動的基礎，在胚胎發(fā)育、免疫防御、損傷修復以及腫瘤轉(zhuǎn)移等許多生理和病理過程中發(fā)揮核心作用[20]。當宿主感染病原體時，為了防止其入侵，免疫細胞會向感染部位遷移，參與機體的免疫防御。本次試驗表明，高濃度的Hc58能顯著增加PBMCs的遷移率，有利于機體清除病原菌和有害物質(zhì)。

細胞凋亡是由基因控制的細胞主動性死亡過程，受多種基因的調(diào)控，對疾病的預防與診治有著重要的意義。本研究中作者發(fā)現(xiàn)重組蛋白Hc58能顯著誘導山羊PBMCs的凋亡，對促進衰老損傷細胞的清除、生物體進化、機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持等有著重要作用。本試驗僅初步研究了重組蛋白質(zhì)對PBMCs凋亡的作用，至于其如何誘導細胞凋亡機制和信號傳導途徑尚不清楚，有待于深入探索。

本文通過重組蛋白質(zhì)Hc58與山羊PBMCs共同作用，體外試驗測定其部分免疫指標，了解到該蛋白質(zhì)對PBMCs發(fā)揮免疫功能具有重要意義，后續(xù)會通過體內(nèi)試驗進一步研究Hc58對山羊免疫保護機制的影響。

4 結 論

體外試驗表明重組蛋白質(zhì)Hc58具有促進NO分泌和細胞的吞噬作用，上調(diào)IL-2、IL-4、IL-17和IFN-γ的表達，顯著增強細胞遷移和凋亡，可通過多種途徑影響山羊PBMCs免疫功能的發(fā)揮。

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