杜吉革，朱 真，薛 麒，李啟紅，印春生，彭小兵，姚文生，康 凱，陳小云

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌舊稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患病原，常常誘發(fā)創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、牛羊腸毒血癥[1-6]，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-12]。產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要致病因子是其分泌的外毒素，該菌可至少分泌18種外毒素，并通過(guò)這些外毒素引起人和動(dòng)物發(fā)病[13]。根據(jù)產(chǎn)生的4種主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)的種類，將該菌分為A、B、C、D、E五個(gè)毒素型[14]。產(chǎn)氣莢膜梭菌病具有發(fā)病急、病程短且死亡率極高的特點(diǎn)[15]，一旦發(fā)病，往往還來(lái)不及治療就因外毒素中毒而發(fā)生猝死，因此免疫接種是防控該病的有效方法。目前，通過(guò)滅活梭菌培養(yǎng)物上清而制備的天然類毒素疫苗是預(yù)防該菌感染的主要疫苗。但該類疫苗制備過(guò)程繁瑣，抗原成分復(fù)雜，有效抗原含量較低，免疫效果不盡理想。因此，篩選安全、有效、純凈的抗原，用于研制新型產(chǎn)氣莢膜梭菌病疫苗，對(duì)預(yù)防該菌感染具有重要意義。

由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的ε毒素(ETX)[16]，是該菌所有外毒素中毒力最強(qiáng)的毒素[17]。該毒素全長(zhǎng)296個(gè)氨基酸，以毒素前體的形式分泌于菌體外[18]。毒素前體被宿主的胰蛋白酶、糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后，去除N端11～13個(gè)以及C端22～29個(gè)氨基酸，從而活化為成熟毒素[19-20]。ETX分子主要分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)區(qū)域，分別在毒素與細(xì)胞受體結(jié)合過(guò)程、與細(xì)胞受體結(jié)合穩(wěn)定性的維持以及細(xì)胞膜穿孔的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[21]。此外，ETX分子中有2條35個(gè)氨基酸的肽鏈同時(shí)跨過(guò)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)區(qū)域[22]。ε毒素的這些特性導(dǎo)致僅使用毒素的一個(gè)域作為疫苗候選抗原的策略(如α、β毒素的C末端[23-24])很難應(yīng)用于該毒素的防控。因此，實(shí)現(xiàn)毒素的減毒甚至無(wú)毒以及構(gòu)建相關(guān)減毒或無(wú)毒突變體，對(duì)于開(kāi)發(fā)毒素基因工程亞單位疫苗及將其作為抗原組分的多價(jià)亞單位疫苗的研究和應(yīng)用就顯得尤為重要。已有的研究發(fā)現(xiàn)，106位組氨酸突變?yōu)楦彼岬闹亟METX基本是無(wú)毒的，且保留了良好的免疫原性[25-27]。此外，Ⅰ區(qū)域內(nèi)的第29、30、36、196以及199位氨基酸的無(wú)毒單突變重組ETX也保留了較好的免疫原性[26,28-29]。

為了最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空間構(gòu)象，保持其免疫原性，同時(shí)避免因單個(gè)氨基酸突變?cè)谖磥?lái)基因工程疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中可能造成的生物安全隱患，本文同時(shí)對(duì)我國(guó)現(xiàn)行D型產(chǎn)氣莢膜梭菌制苗用菌株(C60-2株)ETX基因的30、196和106位氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，通過(guò)原核系統(tǒng)表達(dá)、純化和鑒定，并對(duì)其毒力和免疫原性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素以及pET-30a(+)表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；1.5～2.0 kg普通級(jí)健康日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受態(tài)細(xì)胞Top10和BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司； Montanide ISA 206佐劑購(gòu)自法國(guó)賽彼科(Seppic)公司；Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒、蛋白Marker、Western blot Marker、蛋白溶解液(50 mmol·L-1Tris-HCl, 10% Glycerol, 150 mmol·L-1NaCl, pH 8.0)，均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)購(gòu)自東洋坊公司；PremixTaqversion 2.0、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司。T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promaga公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ購(gòu)自NEB公司；抗His標(biāo)簽單抗、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；明膠緩沖溶液，LB培養(yǎng)基購(gòu)自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優(yōu)化

以D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株ETX編碼基因?yàn)槟０?，按大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)和人工合成。同時(shí)，引入3個(gè)氨基酸點(diǎn)突變，分別是第30位酪氨酸突變?yōu)楸彼?，?06位組氨酸突變?yōu)楦彼幔?96位酪氨酸突變?yōu)楸彼?。此外，在突變基因后添?*His標(biāo)簽蛋白序列。基因合成由中美泰和公司完成，合成的基因稱為GETXm3。

1.3 ETX突變體原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以人工合成的GETXm3基因?yàn)槟０?，采用引物?duì)GETXm3-F/ GETXm3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中上游引物GETXm3-F序列：5′-CGCCATATGAAAGAAATCTC-3′，其5′端引入限制性內(nèi)切酶NdeⅠ位點(diǎn)(下劃線部分)及保護(hù)性堿基；下游引物GETXm3-R序列：5′-CCGCTCGAGTTAGTGGTGATG-3′，其5′端引入限制性內(nèi)切酶XhoⅠ位點(diǎn)(下劃線部分)。PCR體系為50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，共33個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸7 min。

擴(kuò)增得到的目的DNA條帶，經(jīng)回收后，采用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切消化，與經(jīng)過(guò)相同酶切消化的pET30a(+)載體連接。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒送中美泰和公司測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET30a-GETXm3。

1.4 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與鑒定

將pET30a-GETXm3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，分別在37和16 ℃條件下用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)情況及其可溶性，將表達(dá)的目的蛋白質(zhì)稱為rETXm3。采用Western blot方法，以抗His標(biāo)簽蛋白抗體為一抗，對(duì)重組蛋白質(zhì)做進(jìn)一步的鑒定。

1.5 重組蛋白質(zhì)的純化及Western blot鑒定

按照Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)對(duì)菌體裂解上清中呈可溶性表達(dá)的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒓兓蟮哪康牡鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，分別以抗His標(biāo)簽抗體和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行孵育，按照底物顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色，檢測(cè)純化的重組蛋白質(zhì)與抗His標(biāo)簽抗體及D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清的反應(yīng)情況。

1.6 重組蛋白質(zhì)的毒力測(cè)定

已有的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX毒素首先以前體毒素形式分泌，當(dāng)被蛋白酶(如胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶等)切除N端以及C端相應(yīng)的氨基酸后，毒素被活化，從而揮發(fā)相應(yīng)的生物活性[18-20]。活化的ETX對(duì)小鼠的半數(shù)致死量可達(dá)50 ng·kg-1 [30]。本文按照我國(guó)現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015年版)規(guī)定的方法，用終濃度為1%的胰酶對(duì)純化的rETXm3在37 ℃條件下活化1 h。首先對(duì)抗原的免疫劑量和免疫途徑進(jìn)行優(yōu)化，將16～18 g ICR小鼠隨機(jī)分為9組，每組5只。分別用活化前和活化后的rETXm3靜脈注射，注射劑量分為1、10、100 μg 3個(gè)梯度。同時(shí)設(shè)置胰酶消化液(終濃度為1%)以及蛋白溶解液兩個(gè)陰性對(duì)照和1個(gè)MLD的天然毒素陽(yáng)性對(duì)照。其中，樣品均用明膠緩沖液進(jìn)行稀釋，注射的液體總體積為350 μL，觀察2 d，記錄小鼠的存活狀態(tài)。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 免疫程序 將合適濃度的純化rETXm3與Montanide ISA 206佐劑以體積比1∶1的比例配制成rETXm3終質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的疫苗，置4 ℃保存?zhèn)溆?。用體重1.5～2.0 kg健康家兔4只，各頸部皮下注射疫苗，2.0 mL·只-1，免疫后14 d，以相同劑量、相同途徑進(jìn)行二次免疫。另取滅菌PBS與Montanide ISA 206佐劑以體積比1∶1的比例制備對(duì)照疫苗，各頸部皮下注射相同條件的健康家兔4只，2.0 mL·只-1，作為對(duì)照組。

1.7.2 血清中和抗體效價(jià)測(cè)定 分別在一免后14 d以及二免后21 d，對(duì)試驗(yàn)組及對(duì)照組所有兔經(jīng)耳緣靜脈采血，分離血清備用。按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015年版)三部中規(guī)定的方法進(jìn)行血清中和效價(jià)測(cè)定[31]。

1.7.3 攻毒試驗(yàn) 二免后21 d，對(duì)免疫組及對(duì)照組所有家兔經(jīng)耳緣靜脈各注射1 MLD的天然毒素進(jìn)行攻毒，觀察5 d，記錄家兔的死亡情況。根據(jù)免疫組及對(duì)照組家兔的死亡情況，判定試驗(yàn)疫苗的免疫保護(hù)效力。

2 結(jié) 果

2.1 ETX毒素突變體原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用引物GETXm3-F/ GETXm3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后克隆至pET-30a(+)載體。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳觀察，結(jié)果如圖1所示。酶切后出現(xiàn)大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約920 bp的目的基因片段，與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果表明，插入的外源基因序列是正確的。將此重組質(zhì)粒命名為pET30a-GETXm3。

2.2 ETX毒素突變體的原核表達(dá)鑒定

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-GETXm3轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)的目的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為39 ku，大小與預(yù)期相符。表達(dá)的rETXm3重組蛋白質(zhì)在BL21(DE3)菌體中以可溶性和包涵體兩種形式存在(圖2)。圖2a為重組蛋白質(zhì)表達(dá)的SDS-PAGE鑒定結(jié)果，如圖所示，37 ℃、誘導(dǎo)4 h后，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量以及可溶性均優(yōu)于其他誘導(dǎo)條件。為此，確定目的蛋白質(zhì)最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為37 ℃，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收獲細(xì)胞裂解上清。圖2b為重組蛋白質(zhì)的Western blot鑒定結(jié)果，表達(dá)的目的蛋白質(zhì)能與抗His標(biāo)簽抗體發(fā)生反應(yīng)，證明目的蛋白質(zhì)含有His標(biāo)簽，與預(yù)期相符。

1. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 2. 重組質(zhì)粒pET30a-GETXm3 的NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定1. DL5000 DNA marker; 2. pET30a-GETXm3 digested with NdeⅠand XhoⅠ圖1 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a-GETXm3的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pET30a-GETXm3

a.重組蛋白質(zhì)表達(dá)的SDS-PAGE鑒定；b.重組蛋白質(zhì)與抗His單抗反應(yīng)的Western blot；M1. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2. Western blot蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；PC1. BSA (1 μg)；PC2. BSA (2 μg)；NC.未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解物； 1. 細(xì)胞裂解物(15 ℃、16 h誘導(dǎo))；2. 細(xì)胞裂解物(37 ℃、4 h誘導(dǎo))；NC1. 未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解上清；NC2. 未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解沉淀；3. 細(xì)胞裂解上清(15 ℃、16 h誘導(dǎo))； 4. 細(xì)胞裂解沉淀(15 ℃、16 h誘導(dǎo))； 5. 細(xì)胞裂解上清(37 ℃、4 h誘導(dǎo))； 6. 細(xì)胞裂解沉淀(37 ℃、4 h誘導(dǎo))a. The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b. The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot; M1. Protein marker; M2. Protein marker of Western blot；PC1. BSA (1 μg); PC2. BSA (2 μg); NC. The cell lysates without induction; 1. The cell lysates induced with IPTG for 16 h under 15 ℃; 2. The cell lysates induced with IPTG for 4 h under 37 ℃; NC1. The supernatant of cell lysates without induction; NC2. The precipitation of cell lysates without induction; 3.The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 16 h under 15 ℃; 4. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 16 h under 15 ℃; 5. The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 4 h under 37 ℃; 6. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 4 h under 37 ℃圖2 rETXm3的原核表達(dá)與鑒定Fig.2 Prokaryotic expression and identification of rETXm3

2.3 ETX毒素突變體的純化與鑒定

按照Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)rETXm3進(jìn)行純化，收集純度較高的洗脫液進(jìn)行透析，最終獲得的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.302 mg·mL-1，純度可達(dá)90%以上，結(jié)果見(jiàn)圖3a。將純化后的rETXm3經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果rETXm3能夠與抗His標(biāo)簽抗體(圖3b)以及D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清(圖4)發(fā)生反應(yīng)。

a.純化蛋白的SDS-PAGE鑒定；b.純化蛋白與抗His單抗反應(yīng)的Western blot鑒定； M1. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； M2. Western blot蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1. BSA； 2. 純化后的rETXm3a. The identification of purified recombinant protein by SDS-PAGE; b. The identification of purified recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot; M1.Protein marker; M2. Protein marker of Western blot； 1. BSA; 2. rETXm3 after purification圖3 rETXm3的純化與鑒定Fig.3 Purification and identification of rETXm3

2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX突變體的毒性分析

未活化和經(jīng)過(guò)胰酶活化的rETXm3，分別以1、10、100 μg的劑量注射小鼠，結(jié)果注射組以及蛋白溶解液、胰酶消化液兩個(gè)陰性對(duì)照組小鼠，在注射后21 d內(nèi)均存活，未見(jiàn)任何異常。注射1個(gè)MLD天然毒素(0.000 25 mL)的小鼠，在注射24 h內(nèi)全部死亡，說(shuō)明重組表達(dá)的產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX毒素突變體已成功減毒，即使經(jīng)過(guò)胰酶活化后，對(duì)小鼠依然是無(wú)毒的。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后的rETXm3 M. Protein molecular weight marker; 1. rETXm3 after purification圖4 rETXm3與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清的反應(yīng)Fig.4 Interaction of rETXm3with antitoxin serum of Clostridium perfringens type D

2.5 血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定

經(jīng)血清中和法測(cè)定，rETXm3免疫組的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素中和抗體效價(jià)在一免后均大于50 MLD(即0.1 mL家兔血清可中和50 MLD以上的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素)，最高達(dá)60 MLD；二免后中和抗體效價(jià)均大于400 MLD，最高達(dá)450 MLD(表1)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX毒素突變體rETXm3的免疫效力遠(yuǎn)高于現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》的規(guī)定，是優(yōu)良的制苗用候選抗原。

表1rETXm3免疫兔血清對(duì)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和抗體效價(jià)

Table1ThetitersofneutralizationpotencyagainsttoxinsofClostridiumperfringenstypeDgeneratedbyrETXm3inrabbits

分組GroupsrETXm3免疫組RabbitsimmunizedwithrETXm3佐劑免疫組Rabbitsimmunizedwithadjuvant兔編號(hào)NumberP1P2P3P4C1C2C3C4一免后中和抗體效價(jià)(MLD)Theserumneutralizationtitersafterfirstimmunization(MLD)506060550000二免后中和抗體效價(jià)(MLD)Theserumneutralizationtitersaftersecondimmunization(MLD)4004254504200000

2.6 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

二免后21 d，對(duì)所有rETXm3免疫組和佐劑免疫對(duì)照組的家兔，經(jīng)耳緣靜脈注射1 MLD劑量的天然毒素進(jìn)行攻毒，結(jié)果佐劑免疫對(duì)照組家兔在攻毒后5 d內(nèi)全部死亡，rETXm3免疫組家兔全部健活，未見(jiàn)任何不良反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX毒素突變體rETXm3能產(chǎn)生可靠的免疫攻毒保護(hù)效力。

3 討 論

作為一種重要的人畜共患病原，產(chǎn)氣莢膜梭菌不僅嚴(yán)重威脅著人類的健康，而且對(duì)畜牧業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著研究的深入，與產(chǎn)氣莢膜梭菌密切相關(guān)的主要致死性外毒素的結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制越來(lái)越清晰，致死性外毒素的部分無(wú)毒區(qū)域(α、β以及ι毒素的C末端[23-24])或者無(wú)毒突變體(ε[25-26, 28]和θ毒素[32])作為亞單位疫苗抗原已經(jīng)被證實(shí)能夠有效預(yù)防相應(yīng)的毒血癥。作為一種潛在生物武器的ε毒素，其毒力僅次于肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素。該毒素能夠?qū)е录仪莺图倚筇貏e是反芻動(dòng)物強(qiáng)烈的腸毒血癥，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。因此，加強(qiáng)ε毒素防治方面的研究非常必要，尤其需要關(guān)注其生物安全性。李箐[33]通過(guò)原核系統(tǒng)獲得了具有可溶性的重組ε毒素，該蛋白具有較強(qiáng)的毒力，在亞單位疫苗的制備過(guò)程中同樣涉及外毒素的滅活，導(dǎo)致存在毒素外泄或滅活不徹底等生物安全隱患。

在無(wú)毒重組ε毒素亞單位疫苗的研究中，經(jīng)典的無(wú)細(xì)胞毒性的突變體為第106位組氨酸突變?yōu)楦彼岬闹亟Mε毒素蛋白，其安全性和抗原保護(hù)性已經(jīng)得到充分的驗(yàn)證[25-27]。其中，李箐[33]對(duì)ε毒素的第106位組氨酸、第111位色氨酸及第199位苯丙氨酸的突變體進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，rETXH106P的安全性最高。ETX對(duì)犬的腎上皮細(xì)胞(MDCK)的CT50為(37.73±12.55) ng·mL-1，而質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的rETXH106P對(duì)MDCK細(xì)胞仍無(wú)毒力。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，50 ng·mL-1的天然ETX即能引起小鼠死亡。為此，本研究直接選用小鼠來(lái)檢測(cè)rETXm3的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的rETXm3對(duì)小鼠仍無(wú)毒力作用。此外，作為一個(gè)較為經(jīng)典的無(wú)細(xì)胞毒性的突變體rETXH106P，該蛋白的可溶性表達(dá)量非常低[33-34]，如果需要大量生產(chǎn)會(huì)增加純化的難度。然而，本研究中的無(wú)毒重組蛋白rETXm3可溶性表達(dá)量較高，可溶比例可達(dá)到40%，這可能由于按照大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化引起的，或者是其余兩個(gè)點(diǎn)突變更利于rETXm3的可溶表達(dá)。用抗His抗體進(jìn)行Western blot試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未純化的rETXm3顯色膜上出現(xiàn)雜帶，這可能是抗體的濃度過(guò)高引起的(圖2b)。對(duì)于純化后的rETXm3，用抗His抗體進(jìn)行Western blot時(shí)出現(xiàn)單一的條帶(圖3b)，而用D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清作為一抗時(shí)，顯色膜上出現(xiàn)了兩條明顯的條帶(圖4)。因?yàn)镈型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清是通過(guò)滅活的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)物免疫日本大耳白兔制備，抗原不僅含有類毒素，還含菌體的其他成分。為此，筆者認(rèn)為在純化的rETXm3中殘留了一部分原核生物的共有抗原，才導(dǎo)致圖4中出現(xiàn)兩條明顯的條帶。

目前，活化ETX毒素可以采用胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶，3種酶活化ETX的機(jī)制基本相同，均為切除ETX毒素前體蛋白的N端以及C端相應(yīng)的氨基酸，使其活化。但是不同的酶活化后ETX毒素對(duì)小鼠的LD50卻存在很大差異，范圍從50至320 ng·kg-1。目前大多數(shù)的研究論文，以及我國(guó)現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015年版)均采用胰酶進(jìn)行活化，為使本研究的數(shù)據(jù)與其他研究人員的數(shù)據(jù)更具有可比性，故本研究采用了胰酶進(jìn)行活化。

為了進(jìn)一步降低未來(lái)基因工程疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中可能存在的ε毒素基因回復(fù)突變帶來(lái)的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，除了第106位氨基酸的點(diǎn)突變外，本研究同時(shí)還對(duì)ε毒素的第30位和196位氨基酸進(jìn)行了突變。其中，第30位和196位氨基酸均位于ETX的Ⅰ結(jié)構(gòu)域，可能和毒素分子與受體的結(jié)合有關(guān)[29]。第30位氨基酸進(jìn)行突變，能夠降低ε毒素的毒力，但突變后的毒素抗原性沒(méi)有得到深入研究。最近的研究發(fā)現(xiàn)，與rETXY196E相比，添加C-末端氨基酸的rETXY196E(rETXY196E-C)毒力更低，且具有良好的免疫原性[28]。然而，添加C-末端氨基酸的重組突變體仍然有被蛋白酶重新切掉的可能，存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。本文的研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)有三個(gè)點(diǎn)突變的重組毒素rETXm3，在本文的檢測(cè)濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠沒(méi)有毒力作用，具有很高的安全性，但仍然保留了良好的免疫原性。由于ETX分子中有2條35個(gè)氨基酸的肽鏈同時(shí)跨過(guò)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)區(qū)域[22]，導(dǎo)致僅使用ETX分子的一個(gè)域作為疫苗候選抗原的策略(如α、β毒素的C末端[23-24])很難應(yīng)用于該毒素的防控。因此，對(duì)于ε毒素的突變體研究通常聚焦在突變個(gè)別氨基酸位點(diǎn)，而直接去掉某個(gè)氨基酸的研究還沒(méi)有報(bào)道。為此，制備免疫原性良好的缺失某些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的無(wú)毒ETX分子將是我們后續(xù)研究的重點(diǎn)。

由于致病的梭菌種類較多，且?；旌细腥?，導(dǎo)致梭菌病的預(yù)防多采用聯(lián)苗，以達(dá)到一針多防的目的。該類疫苗均為天然毒素經(jīng)甲醛脫毒后制備的類毒素疫苗，其抗原成分復(fù)雜，有效抗原量較低，導(dǎo)致效果不理想。特別是聯(lián)苗中每種菌株的類毒素免疫量均較高，組合后的總免疫量過(guò)大，容易引起動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)。根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015年版)三部的規(guī)定，在此類疫苗檢驗(yàn)中，對(duì)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔血清中和效價(jià)達(dá)到3 MLD即可判為合格。雖然該標(biāo)準(zhǔn)為疫苗的最低標(biāo)準(zhǔn)，但從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所歷年的獸用生物制品監(jiān)督檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，目前我國(guó)該類疫苗的免疫效力不容樂(lè)觀，疫苗抽檢不合格的情況時(shí)有發(fā)生[35]。彭小兵等對(duì)自2006 年至2015年間的此類疫苗檢驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，以血清中和法檢驗(yàn)后效力不符合規(guī)定的產(chǎn)品共有33批，其中β毒素組分效力不符合規(guī)定(低于1 MLD)的比例最高，約為72.7%[36]。然而，鑒于此類聯(lián)苗免疫劑量的限制，無(wú)法再大幅度增加β類毒素的比例。為此，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素亞單位疫苗的研制顯得極為重要。在一定的范圍內(nèi)，我們可以最大幅度地增大免疫原性較差的毒素抗原，從而提高聯(lián)苗總體的免疫保護(hù)作用。而本研究中制備的rETXm3一免兔血清中和效價(jià)可達(dá)50 MLD，二免后甚至可達(dá)400 MLD，效果明顯優(yōu)于目前的商品化疫苗。這說(shuō)明ε毒素的30、106和196氨基酸突變后，毒力基本消失，但仍保留了良好的免疫原性，是我國(guó)現(xiàn)行D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素疫苗升級(jí)換代的理想候選疫苗抗原。

4 結(jié) 論

優(yōu)化設(shè)計(jì)并克隆D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素編碼基因，在原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)。ε毒素的重組蛋白質(zhì)為可溶性表達(dá)，且能與該菌ε毒素抗血清反應(yīng)；重組蛋白質(zhì)免疫兔血清對(duì)該菌ε毒素的中和效價(jià)較高；用該菌ε毒素攻毒后，對(duì)照小鼠全部死亡，重組蛋白質(zhì)免疫組得到保護(hù)?？梢?jiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌重組ε毒素突變體無(wú)毒力且保留了良好的免疫原性。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] MCCLANE B A, UZAL F A, MIYAKAWA M E, et al. The enterotoxic clostridia[M]//FALKOW S, DWORKIN M, ROSENBURG E, et al. The Prokaryotes. New York, NY, USA: Springer, 2006: 698-752.

[2] HATHEWAY C L. Toxigenic clostridia[J].ClinMicrobiolRev,1990, 3(1): 66-98.

[3] SONGER J G. Clostridial enteric diseases of domestic animals[J].ClinMicrobiolRev, 1996, 9(2): 216-234.

[4] NOVAK J S, JUNEJA V K.Clostridiumperfringens: hazards in new generation foods[J].InnovFoodSciEmergTechnol,2002, 3(2): 127-132.

[5] UZAL F A, FREEDMAN J C, SHRESTHA A, et al. Towards an understanding of the role ofClostridiumperfringenstoxins in human and animal disease[J].FutureMicrobiol,2014, 9(3): 361-377.

[7] FERREIRA M R A, MOREIRA G M S G, DA CUNHA C E P, et al. Recombinant Alpha, Beta, and epsilon toxins ofClostridiumperfringens: production strategies and applications as veterinary vaccines[J].Toxins, 2016, 8(11): 340-363.

[8] 王瑩瑩，喬藝然，趙 蕾, 等. 產(chǎn)氣莢膜梭菌重組NetB毒素細(xì)胞毒性作用研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 47(5): 1018-1025.

WANG Y Y, QIAO Y R, ZHAO L, et al. The study on cytotoxicity of recombinant NetB toxin ofClostridiumperfringens[J].ActaVeterinatriaetZootechnicaSinica， 2016, 47(5): 1018-1025. (in Chinese)

[9] 柳美玲, 王愛(ài)華, 陳鳳梅, 等. 淺析牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2015(2): 59-61.

LIU M L, WANG A H, CHEN F M, et al.Clostridiumperfringensin cattle industry[J].ShandongJournalofAnimalScienceandVeterinaryMedicine, 2015(2): 59-61. (in Chinese)

[10] 釧有科, 肖 嘯, 濮永華, 等. 努比亞山羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診治[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2014, 50(12): 42-43.

CHUAN Y K, XIAO X, PU Y H, et al. Diagnosis and treatment ofClostridiumperfringensinfection in Nubian goats[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine, 2014, 50(12): 42-43. (in Chinese)

[11] VAN IMMERSEEL F, DE BUCK J, PASMANS F, et al.Clostridiumperfringensin poultry: an emerging threat for animal and public health[J].AvianPathol, 2004, 33(6): 537-549.

[12] 鄭曉麗, 宋振銀, 倪學(xué)勤. 產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)家禽業(yè)的危害及其預(yù)防[J]. 中國(guó)家禽, 2008, 30(24): 69-71.

ZHENG X L, SONG Z Y, NI X Q. Emerging threat and prevention ofClostridiumperfringensin poultry industry[J].ChinaPoultry, 2008, 30(24): 69-71. (in Chinese)

[13] REVITT-MILLS S A, ROOD J I, ADAMS V.Clostridiumperfringensextracellular toxins and enzymes: 20 and counting[J].MicrobiolAust, 2015, 36(3): 114-117.

[14] NIILO L.Clostridiumperfringensin animal disease: A review of current knowledge[J].CanVetJ, 1980, 21(5): 141-148.

[15] LEBRUN M, MAINIL J G, LINDEN A. Cattle enterotoxaemia andClostridiumperfringens: description, diagnosis and prophylaxis[J].VetRec,2010, 167(1): 13-22.

[16] SAYEED S, LI J H, MCCLANE B A. Virulence plasmid diversity inClostridiumperfringenstype D isolates[J].InfectImmun, 2007, 75(5): 2391-2398.

[17] SAKURAI J. Toxins ofClostridiumperfringens[J].RevMedMicrobiol, 1995, 6(3): 175-185.

[18] HUNTER S E, CLARKE I N, KELLY D C, et al. Cloning and nucleotide sequencing of theClostridiumperfringensepsilon-toxin gene and its expression inEscherichiacoli[J].InfectImmun, 1992, 60(1): 102-110.

[19] MINAMI J, KATAYAMA S, MATSUSHITA O, et al. Lambda-toxin ofClostridiumperfringensactivates the precursor of epsilon-toxin by releasing its N-and C-terminal peptides[J].MicrobiolImmunol, 1997, 41(7): 527-535.

[20] FREEDMAN J C, MCCLANE B A, UZAL F A. New insights intoClostridiumperfringensepsilon toxin activation and action on the brain during enterotoxemia[J].Anaerobe, 2016, 41: 27-31.

[22] COLE A R, GIBERT M, POPOFF M, et al.Clostridiumperfringensε-toxin shows structural similarity to the pore-forming toxin aerolysin[J].NatStructMolBiol, 2004, 11(8): 797-798.

[23] NAGAHAMA M, ODA M, KOBAYASHI K, et al. A recombinant carboxy-terminal domain of alpha-toxin protects mice againstClostridiumperfringens[J].MicrobiolImmunol, 2013, 57(5): 340-345.

[24] DAS S, MAJUMDER S, KINGSTON J J, et al. Generation and characterization of recombinant bivalent fusion protein r-Cpib for immunotherapy againstClostridiumperfringensbeta and iota toxemia[J].MolImmunol, 2016, 70: 140-148.

[25] ALIMOLAEI M, GOLCHIN M, DANESHVAR H. Oral immunization of mice againstClostridiumperfringensepsilon toxin with aLactobacilluscaseivector vaccine expressing epsilon toxoid[J].InfectGenetEvol, 2016, 40: 282-287.

[26] LI Q, XIN W W, GAO S, et al. A low-toxic site-directed mutant ofClostridiumperfringensε-toxin as a potential candidate vaccine against enterotoxemia[J].HumVaccinImmunother, 2013, 9(11): 2386-2392.

[27] DORCA-ARéVALO J, PAUILLAC S, DAZ-HIDALGO L, et al. Correlation betweeninvitrocytotoxicity andinvivolethal activity in mice of epsilon toxin mutants fromClostridiumperfringens[J].PLoSOne, 2014, 9(7): e102417.

[28] YAO W W, KANG J J, KANG L, et al. Immunization with a novelClostridiumperfringensepsilon toxin mutant rETXY196E-C confers strong protection in mice[J].SciRep, 2016, 6: 24162.

[29] IVIE S E, MCCLAIN M S. Identification of amino acids important for binding ofClostridiumperfringensepsilon toxin to host cells and to HAVCR1[J].Biochemistry, 2012, 51(38): 7588-7595.

[30] BOKORI-BROWN M, SAVVA C G, DA COSTA S P F, et al. Molecular basis of toxicity ofClostridiumperfringensepsilon toxin[J].FEBSJ, 2011, 278(23): 4589-4601.

[31] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典,2015年版三部[S]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2016: 45-46.

Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. Veterinary pharmacopoeia of the People’s Repubilc of China volume Ⅲ 2015 edition[S]. Beijing: China Agriculture Press, 2016: 45-46. (in Chinese)

[32] VERHERSTRAETEN S, GOOSSENS E, VALGAEREN B, et al. Non-toxic perfringolysin O and α-toxin derivatives as potential vaccine candidates against bovine necrohaemorrhagic enteritis[J].VetJ, 2016, 217: 89-94.

[33] 李 箐. 產(chǎn)氣莢膜梭菌α、ε毒素突變體構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 合肥: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2013.

LI Q. Construction of mutants ofClostridiumperfringensalpha, epsilon toxin and its application[D]. Hefei: Anhui Medical University, 2013. (in Chinese)

[34] OYSTON P C, PAYNE D W, HAVARD H L, et al. Production of a non-toxic site-directed mutant ofClostridiumperfringensε-toxin which induces protective immunity in mice[J].Microbiology, 1998, 144(2): 333-341.

[35] 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局.農(nóng)業(yè)部關(guān)于2015年第一期獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽檢情況的通報(bào)[EB/OL]. (2015-04-02)[2017-12-22]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201504/t20150402_4472055.htm.

Veterinary Bureau of the Ministry of Agriculture of PRC. Report of the Ministry of agriculture on the inspection of the first phase of the quality supervision of veterinary drugs in 2015 [EB/OL]. (2015-04-02)[2017-12-22]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201504/t20150402_4472055.htm. (in Chinese)

[36] 彭小兵, 田冬青, 彭國(guó)瑞, 等. 產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素的表達(dá)及其抗血清的制備[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2015, 47(10): 93-96.

PENG X B, TIAN D Q, PENG G R, et al. Expression ofClostridiumperfringensβ toxin and preparation of its antiserum[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2015, 47(10): 93-96. (in Chinese)