趙子君，饒明章，陳 建，張 杰，袁麗霞，廖 明，曹偉勝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALVs)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、α反轉(zhuǎn)錄病毒屬，是一類能夠引起禽類多種腫瘤性疾病的病毒群，對養(yǎng)禽生產(chǎn)危害巨大。根據(jù)宿主范圍、囊膜蛋白抗原性和交叉中和反應(yīng)等，將其分為A～K共11個亞群，其中A～D、J和K亞群為外源性ALV，而 C、D亞群在野外極為少見[1]；E～I(xiàn) 亞群為內(nèi)源性 ALV，其中 E 亞群為整合在雞染色體中一種前病毒 DNA，在雞群中普遍存在，而 F～I(xiàn) 亞群主要感染野生禽類，包括雉、鷓鴣和鵪鶉等[2]。

K亞群禽白血病病毒(ALV-K)是2012年王鑫等[3-4]首次從我國地方品種蘆花雞中分離到的新亞群，隨后，2014年郝建勇等[5]、2016年X.J.Li等[6]以及2017年H. X. Shao等[7]在我國地方雞群中也分離到ALV-K。將這些新分離的ALV-K LTR部分與其余已知亞群LTR進(jìn)行序列比對分析發(fā)現(xiàn)，除了王鑫等[3-4]分離到的ALV-K LTR部分屬于外源性ALV外，其余地方分離到的ALV-K LTR部分均屬于內(nèi)源性ALV。值得注意的是，這種LTR為內(nèi)源性的ALV-K毒株與我國臺灣地區(qū)發(fā)生的神經(jīng)膠質(zhì)瘤突變株TW3539[8]高度相似，并且我國臺灣地區(qū)的研究報道認(rèn)為LTR為內(nèi)源性的ALV-K在臺灣地區(qū)很常見[8]。目前，本課題組還分離到14株LTR為內(nèi)源性的ALV-K毒株，推測LTR是內(nèi)源性的ALV-K毒株可能一直存在于我國地方品種雞中。

ALV前病毒基因組結(jié)構(gòu)中含兩段長末端重復(fù)序列(5′LTR和3′LTR)，包括R區(qū)、U5區(qū)和U3區(qū)，負(fù)責(zé)控制病毒基因的轉(zhuǎn)錄，不編碼蛋白質(zhì)，其中5′LTR是ALV基因表達(dá)的調(diào)控中心，與病毒復(fù)制、 翻譯、 致瘤等密切相關(guān)。內(nèi)源性和外源性ALV具有相同的結(jié)構(gòu)特征，但LTR部分差異較大。張青嬋[9]研究發(fā)現(xiàn)帶有內(nèi)源性LTR的ALV在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制顯著低于帶有外源性LTR的ALV，病毒滴度可相差100倍，其推測ALV基因組中的LTR序列與ALV在細(xì)胞上的復(fù)制水平以及致病性有關(guān)，但未對LTR的啟動活性作進(jìn)一步探究。

本研究以源于廣東某黃羽祖代種雞場健康雞群中分離到的ALV-K毒株(GDFX0601)作為研究對象，比較分析了其5′LTR核苷酸序列，并評估了ALV-K(GDFX0601)在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制能力，且分別在DF-1、CEF和293T細(xì)胞上評估了不同亞群ALV毒株5′LTR的啟動活性差異。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞和質(zhì)粒

pGL3-Basic、pGL3-Control和pRL-TK海腎熒光素酶載體購自美國Promega公司。DF-1細(xì)胞、CEF細(xì)胞、293T細(xì)胞和ALV-K毒株(GDFX0601)、ALV-A毒株(GD13)、ALV-B毒株(CD08)和ALV-J毒株(CHN06)均由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 LTR片段的擴(kuò)增與序列分析

ALV-K毒株(GDFX0601)和ALV-J毒株(CHN06)前病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和回收后，分別克隆至pMD18-T載體中，陽性重組質(zhì)粒送至上海Invitrogen公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用生物學(xué)軟件DNAStar7.1及在線軟件TFSEARCH進(jìn)行序列相似性分析和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析。

1.3 ALV-K(GDFX0601)在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制

將ALV-K毒株(GDFX0601)、ALV-A毒株(GD13)、ALV-B毒株(CD08)和ALV-J毒株(CHN06)，以每孔接種100 μL毒液(103.5TCID50)，分別接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5% CO2、10% FBS、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待接種毒液后第2天，細(xì)胞長滿單層后，換為1% FBS的細(xì)胞維持液進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)7 d，期間持續(xù)監(jiān)測細(xì)胞的生長情況，收集1～7 d的細(xì)胞上清液用IDEXX公司的Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit進(jìn)行檢測，使用前試劑盒中所有試劑(包括包被板)應(yīng)回溫2 h以上，使其恢復(fù)至室溫(18～25 ℃)，試劑及凍融樣品在使用前應(yīng)輕輕振搖徹底混勻。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pGL3-Basic-GDFX0601-LTR、pGL3-Basic-CHN06-LTR、pGL3-Basic-ev-1-LTR、pGL3-Basic-JS11C1-LTR的構(gòu)建。將ALV-K(GDFX0601)、ALV-J、ALV-E和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1) LTR的PCR產(chǎn)物和不含啟動子的螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic分別用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后回收。將雙酶切后的LTR回收產(chǎn)物分別與pGL3-Basic進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒經(jīng)初步鑒定正確后送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證。

1.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

用OMEGA去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提pGL3-Basic-GDFX0601-LTR、pGL3-Basic-CHN06-LTR、pGL3-Basic-ev-1-LTR、pGL3-Basic-JS11C1-LTR質(zhì)粒。消化前期準(zhǔn)備的DF-1細(xì)胞、CEF細(xì)胞和293T細(xì)胞，鋪24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，10% FBS，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。24 h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Corning公司24孔 細(xì)胞培養(yǎng)板每孔轉(zhuǎn)染體系為：1 μg質(zhì)粒(900 ng重組質(zhì)粒和100 ng 海腎熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒)和2.5 μL POLOdeliverer 3000分別用50 μL Opti-MEM?稀釋并孵育5 min，然后再混合，共同孵育15 min，將100 μL質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到準(zhǔn)備好的24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中。按照上海銳賽POLOdeliverer 3000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6 熒光素酶的檢測

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，按Promega雙熒光檢測試劑盒(Dual -Luciferase?Reporter Assay System)說明書操作進(jìn)行熒光素酶的檢測。主要步驟有用細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞，檢測螢火蟲熒光信號和海腎熒光信號，二者比值即為重組質(zhì)粒啟動活性。

2 結(jié) 果

2.1 LTR相似性及轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)分析

利用DNAStar7.1基因分析軟件對ALV-K(GDFX0601)毒株的LTR基因核苷酸序列與GenBank中已公開發(fā)表的國內(nèi)外各參考毒株的LTR基因核苷酸序列進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)外源性ALV LTR的大小在325 bp左右，內(nèi)源性ALV LTR的大小在274 bp左右，ALV-J國外參考株(HPRS103)的LTR長度為325 bp，其中U3為224 bp，R為21 bp，U5為80 bp。經(jīng)典外源性ALV-A、ALV-B和ALV-J之間LTR的相似性在80%左右，與內(nèi)源性ALV-E LTR的相似性最高只有70%左右。將本課題組分離到的ALV-K(GDFX0601)毒株進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)其LTR與ALV-E相似性高達(dá)98.5%，與外源性ALV相似性只有70%(圖1)，與已報道的臺灣株(TW3539)相似性達(dá)99%(圖1)。

上三角表示相似性，下三角表示分歧度Data in upper-triangle is percent indentity, data in lower-triangle is divergence圖1 ALV-K(GDFX0601)與不同亞群ALV參考株LTR基因核苷酸序列相似性分析Fig.1 The homology of nucleotide sequences of LTR of subgroup K ALV isolates and other reference strains

2.2 LTR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

ALV-K (GDFX0601) LTR與其他參考毒株相比R區(qū)域與所有參考毒株相似性較高，U5區(qū)域和外源性病毒有83.3% ～93.6%的相似性，相似性也較高，而包括CArG box、Y box、PRE box、CAAT box和 TATA box 等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的U3 區(qū)域與外源性病毒差異較大，其中CAAT box、CArG box和TATA box均有堿基突變(圖2)。ALV-K (GDFX0601) LTR U3 區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和ALV-E一致，相對保守(圖2)。

2.3 ALV-K(GDFX0601)在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制動力學(xué)

將ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K(GDFX0601)接種DF-1細(xì)胞培養(yǎng)，連續(xù)7 d取細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA檢測p27抗原，檢測結(jié)果顯示：ALV-K(GDFX0601)在DF-1細(xì)胞上的增殖能力顯著低于ALV-A、ALV-B和ALV-J (P<0.05，圖3)。這表明ALV-K(GDFX0601)在細(xì)胞上的復(fù)制速度與其感染能力弱于ALV-A、ALV-B和ALV-J。

箭頭表示U3區(qū)、R區(qū)和U5區(qū)劃分；·代表堿基相同，而字母代表堿基突變；-代表堿基缺失；方框代表不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件The arrows indicate the division of the U3, R and U5 zones; Dots (·) indicate identical residues, while letters indicate base substitutions. Dashes (-) indicate gaps in the alignment. Locations of putative transcriptional regulatory elements are indicated in boxes and are marked圖2 ALV LTR各區(qū)域核苷酸序列及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析Fig.2 Nucleotide sequence alignments and motifs of the ALV LTR region

圖3 ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K在DF-1細(xì)胞中復(fù)制Fig.3 Replication of the ALV-A, ALV-B, ALV-J, and ALV-K in DF-1 cells

2.4 在DF-1上各毒株LTR啟動活性的比較

在DF-1細(xì)胞上轉(zhuǎn)染ALV-K(GDFX0601)LTR、 ALV-J(HN06)LTR、ALV-E (ev-1) LTR和ALV-K(JS11C1)LTR含熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示ALV-K(GDFX0601)LTR重組質(zhì)粒的熒光素酶的平均相對表達(dá)量均低于ALV-J(CHN06)LTR和王鑫等[3]分離到的LTR為外源性的ALV-K (JS11C1)LTR重組質(zhì)粒，但高于ALV-E (ev-1) LTR(圖4)。

圖4 含不同LTR重組質(zhì)粒在DF-1細(xì)胞的熒光素酶啟動活性分析Fig.4 Luciferase activity analysis of DF-1 cells with different LTR recombinant plasmids

2.5 在CEF上各毒株LTR啟動活性的比較

由于ALV-K(GDFX0601)的LTR部分屬于內(nèi)源性ALV，本研究又在可感染ALV-E 的CEF細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與在DF-1細(xì)胞上一致(圖5)，說明ALV-K(GDFX0601)毒株LTR的啟動活性比ALV-J和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)毒株LTR的啟動活性弱。

圖5 含不同LTR重組質(zhì)粒在CEF細(xì)胞的熒光素酶啟動活性分析Fig.5 Luciferase activity analysis of CEF cells with different LTR recombinant plasmids

2.6 在293T上各毒株LTR啟動活性的比較

本研究同時在293T細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染含ALV-K(GDFX0601)LTR重組質(zhì)粒的熒光素酶的平均相對表達(dá)量也均低于轉(zhuǎn)染ALV-J(CHN06)LTR和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)LTR重組質(zhì)粒，但高于轉(zhuǎn)染內(nèi)源性ALV(ev-1)LTR(圖6)。結(jié)果再次說明LTR屬于內(nèi)源性毒株的ALV-K(GDFX0601)的LTR的啟動活性比外源性ALV-J毒株和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)毒株的LTR的啟動活性弱。

圖6 含不同LTR重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞的熒光素酶啟動活性分析Fig.6 Luciferase activity analysis of 293T cells with different LTR recombinant plasmids

3 討 論

近幾年來，ALV在我國流行情況依然嚴(yán)重，不同亞群ALV感染我國地方品系雞均有相關(guān)報道，包括ALV-A、B、E、J、K[3,10-12]。中國作為養(yǎng)禽大國，養(yǎng)殖數(shù)量大、品種多、養(yǎng)殖場分散，使得ALV的凈化和防控難以有效實(shí)施，加上禽白血病可通過垂直傳播，嚴(yán)重影響雛雞的質(zhì)量，還可引起雞群直接發(fā)病而死亡或使感染雞群產(chǎn)生免疫抑制而繼發(fā)其他疾病，從而降低疫苗免疫應(yīng)答效果，影響雞的生產(chǎn)性能[13-15]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。在外源性ALV中，以ALV-A、ALV-B和ALV-J為主，對養(yǎng)禽生產(chǎn)的危害較大[13]。2012年，王鑫等[3-4]從我國蘆花雞中分離到3株毒株，鑒于其gp85基因不同于其他各已知亞群，故將其命名為ALV-K；隨后，2014年郝建勇等[5]和2016年X.J.Li等[6]從廣東地方品系雞中、2017年H. X. Shao等[7]從江蘇也分離到該亞群病毒，ALV-K在我國地方種雞中逐漸流行起來。2017年從山東地區(qū)肉雞中鑒定到一株ALV-K并完成其全基因組序列分析[16]。值得注意的是，2014年后分離到的ALV-K 其LTR部分均屬于內(nèi)源性ALV，大小與內(nèi)源性病毒相近，而王鑫等[3]分離到的ALV-K的LTR大小與外源性病毒相近。

ALV基因組結(jié)構(gòu)主要由5′LTR-gag-pol-env-LTR3′組成，長末端重復(fù)序列LTR不編碼蛋白質(zhì)，分別由3′獨(dú)特區(qū)U3、 短重復(fù)區(qū)R 及 5′獨(dú)特區(qū)U5 3部分組成。ALV的LTR與病毒復(fù)制、 翻譯、 致瘤等密切相關(guān)[17]。5′LTR是反轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)的調(diào)控中心。ALV-K作為新的亞群，近些年在我國很多地方品系雞中被分離到[3, 5-7]，但有關(guān)其生物學(xué)特性的研究報道相對較少，本研究以LTR為內(nèi)源性的ALV-K(GDFX0601)毒株為研究對象，感染DF-1細(xì)胞并將其LTR部分克隆進(jìn)pGL3-Basic載體。對LTR基因核苷酸序列進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)ALV-K(GDFX0601)LTR部分大小只有274 bp，與內(nèi)源性ALV LTR相似性大于98.5%，而與外源性ALV LTR相似性小于72.5%；LTR區(qū)的U3是強(qiáng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控單位，決定LTR啟動活性強(qiáng)弱，序列分析結(jié)果顯示ALV-K(GDFX0601)U3區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件與其他外源性ALV差異較大，與內(nèi)源性ALV相似性較高。本研究進(jìn)一步將ALV-K(GDFX0601)接種DF-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LTR為內(nèi)源性的ALV-K(GDFX0601)在細(xì)胞上的復(fù)制速度較LTR為外源性毒株慢，這與張青嬋[9]將LTR為內(nèi)源性及外源性的ALV-A同時接種DF-1細(xì)胞的研究結(jié)果一致，LTR為內(nèi)源性的毒株在DF-1細(xì)胞上復(fù)制更慢，病毒滴度更低。由于LTR為內(nèi)源性的毒株復(fù)制速度慢，可致p27抗原表達(dá)水平低，易使ELISA方法漏檢已感染這類外源性病毒的雞，從而造成廣泛傳播，這應(yīng)該引起足夠的重視。根據(jù)研究結(jié)果推測ALV-K(GDFX0601)的復(fù)制能力低可能與其5′LTR基因密切相關(guān)。

本課題組張賀楠等[18]在體外細(xì)胞水平分析顯示不同病變型ALV-J國內(nèi)分離株LTR之間的啟動活性差異不顯著，之后本課題組馮少珍等[19]研究發(fā)現(xiàn)ALV-J LTR啟動活性高于ALV-A和ALV-B，但其并未報道ALV-E LTR的啟動活性。因此，本研究選擇ALV-J (CHN06)、ALV-E (ev-1)、ALV-K (GDFX0601)和LTR為外源性的ALV-K (JS11C1) 5′LTR作為研究對象，分析LTR啟動活性差異，為了避免重復(fù)，本研究沒有選擇ALV-A和ALV-B LTR。pGL3-Basic載體缺少啟動子序列，但有熒光素酶報告系統(tǒng)，將LTR序列插入pGL3-Basic載體，可以通過檢測熒光素酶活性，反映LTR啟動活性的強(qiáng)弱；pGL3-Control載體具有啟動子序列，能啟動熒光素酶的表達(dá)，作為對照；PRL海腎熒光素酶載體為內(nèi)參。5′LTR的啟動活性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALV-K(GDFX0601) LTR的啟動活性比ALV-J(HN06)和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)的啟動活性弱。由于LTR為內(nèi)源性的ALV-K啟動活性弱，而導(dǎo)致其復(fù)制能力低，使得ELISA檢測血漿或者泄殖腔樣本時漏檢。目前我國地方品系雞群中分離到的LTR為內(nèi)源性的ALV-K，究竟是王鑫等[3]分離到的ALV-K毒株在凈化演變過程中與內(nèi)源性病毒發(fā)生了重組，還是內(nèi)源性病毒與外源性病毒發(fā)生重組從而產(chǎn)生LTR屬于外源性的ALV-K毒株，即ALV-K本身LTR是內(nèi)源性還是外源性還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

大部分反轉(zhuǎn)錄病毒LTR序列不僅具有真核生物啟動活性，而且具有原核細(xì)胞啟動活性，目前鮮有對ALV-K 5′LTR啟動活性研究的報道。本研究驗(yàn)證了LTR屬于內(nèi)源性的ALV-K(GDFX0601)的 5′LTR啟動活性低于5′LTR屬于外源性的ALV毒株(P<0.05)，這可能是ALV-K(GDFX0601)復(fù)制能力和致病性弱的原因。同時試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ALV-K (GDFX0601)毒株LTR啟動活性高于轉(zhuǎn)染ALV-E(ev-1)毒株LTR，究其LTR屬于內(nèi)源性毒株的ALV-K (GDFX0601)LTR比內(nèi)源性毒株LTR啟動活性高的原因，推測與LTR U3區(qū)堿基的突變有關(guān)。本研究也為進(jìn)一步研究內(nèi)源性ALV LTR調(diào)控病毒復(fù)制的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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