郭 威，郭曉軍，周 賢，李術(shù)娜，朱寶成*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，保定 071000； 2. 河北眾邦生物技術(shù)有限公司，保定 071000)

我國每年產(chǎn)各類農(nóng)作物秸稈近8億噸，但其飼料轉(zhuǎn)化利用率不足30%。秸稈主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素組成，傳統(tǒng)的秸稈加工方法不能改變秸稈的組織結(jié)構(gòu)，牲畜消化吸收率低。為了將秸稈加工轉(zhuǎn)化成優(yōu)質(zhì)飼草，提高消化吸收利用率，研究者利用微生物發(fā)酵農(nóng)作物秸稈加工處理技術(shù)，有效改變了秸稈的細胞組織結(jié)構(gòu)，降低了木質(zhì)纖維素含量，同時生產(chǎn)了大量的微生物菌體蛋白，經(jīng)過大量的飼喂試驗顯示，飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高，牲畜生長速度明顯加快，養(yǎng)殖效益增加[1-2]。李紅亞等[3-4]利用傅立葉紅外光譜(FTIR)和氣質(zhì)聯(lián)用色譜(GC/MS)驗證了功能菌株對木質(zhì)纖維素的降解作用。李術(shù)娜等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵玉米秸稈可顯著提高育肥羊能量代謝水平，促進能量沉積與利用，提高凈能?；坌‰p[6]用發(fā)酵玉米秸稈飼喂新吉細毛羊，不僅能夠提高試羊的生長性能和瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸濃度，同時還可以降低甲烷排放量。

纖維素是反芻動物一種必需的營養(yǎng)素，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸能為反芻動物提供能量需要的65%～75%[7]，但是20%～70%的纖維可能不能被動物直接降解利用，絕大多數(shù)歸功于瘤胃微生物的幫助[8]。瘤胃微生物數(shù)量龐大、種類繁多，共同參與反芻動物體內(nèi)纖維、淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，其中瘤胃細菌是瘤胃微生物中最大和最重要的群體[9-10]。高通量測序技術(shù)(又稱第二代測序技術(shù))，具有測序通量高、準確度高、性價比高等優(yōu)點，已被廣泛應用于反芻動物瘤胃微生物的研究[11-16]。然而前人研究多集中在不同飼草來源和飼糧精粗比對瘤胃微生物的影響，很少考慮同種纖維來源的飼草經(jīng)過不同處理后不同營養(yǎng)組分對瘤胃微生物的影響。

本試驗選用去穗玉米秸稈為粗飼料來源，分別進行青貯和利用復合微生物菌劑發(fā)酵，借助16S rDNA高通量測序技術(shù)研究青貯和發(fā)酵玉米秸稈對綿羊瘤胃細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 玉米秸稈發(fā)酵菌劑

玉米秸稈發(fā)酵菌劑由枯草芽胞桿菌MZS-3-6、枯草芽胞桿菌XWS-8和酵母菌JM-1組成。其中枯草芽胞桿菌MZS-3-6、XWS-8具有降解纖維素和木質(zhì)素的功能[3-4]，枯草芽胞桿菌MZS-3-6、XWS-8和酵母菌JM-1均具有利用無機氮源生長轉(zhuǎn)化為菌體蛋白的功能[1-2]。

1.2 發(fā)酵玉米秸稈的制作

取去穗青玉米秸稈，添加河北眾邦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的復合微生物發(fā)酵菌劑(有效活菌數(shù)1.0×1010CFU·g-1，100 g/T)、硫酸銨(3.0%/T)，混合均勻后裝袋厭氧發(fā)酵60 d。青貯不加發(fā)酵菌劑。青貯、發(fā)酵玉米秸稈的主要營養(yǎng)組分見表1。

1.3 試驗動物和樣品采集

選用裝有瘤胃瘺管的南非肉用美利奴羊(♂)×東北細毛羊(♀)的F1代成年公羊12只，隨機分為兩組，每組6只。日糧參考美國NRC(1985)綿羊飼養(yǎng)標準配制，營養(yǎng)水平見表2。分別在飼喂前1 d，飼喂第7 天、第21 天晨飼后6 h取瘤胃液，每組同一時間所取樣品混合均勻，分別命名為青貯組(YD0、YD7、YD21)和發(fā)酵組(YS0、YS7、YS21)。

表1發(fā)酵及青貯玉米秸稈的主要營養(yǎng)成分比較(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table1Themainnutrientcomponentsoffermentedandsilagecornstalk(DMbasis) %

表2試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table2Compositionandnutrientlevelsofexperimentaldiets(DMbasis) %

1). 預混料為每千克飼糧提供：VA 15 000 IU，VD 5 000 IU，VE 50 mg，F(xiàn)e 90 mg，Cu 12.5 mg，Mn 50 mg，Zn 100 mg，I 0.8 mg，Co 0.5 mg；2). CP、Ca、P為實測值，DE、NDF、ADF為計算值

1). The premix provided the following per kg of diets：VA 15 000 IU，VD 5 000 IU，VE 50 mg，F(xiàn)e 90 mg，Cu 12.5 mg，Mn 50 mg，Zn 100 mg，I 0.8 mg，Co 0.5 mg；2). CP, Ca and P were measured values, while DE, NDF and ADF were calculated values

1.4 DNA提取和擴增

每個樣品用4層綿紗布過濾，濾液經(jīng)12 000 r·min-1離心15 min，取其沉淀。用DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取瘤胃液細菌樣本。每個樣本提取兩次DNA，將兩次提取的DNA混合均勻后作為16S rDNA和序列分析的模板。DNA的質(zhì)量和純度用Nanodrop 2000檢測。

1.5 高通量測序

利用Hiseq測序裝置對各樣品的16S rDNA基因V3～V4區(qū)進行擴增。引物選用340F(5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′)和805R(5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′)，其中引物340F的5′尾端帶有條形碼標記。PCR反應體系(50 μL)：5 μL 10×Buffer A，1 μL dNTP(10 mmol·L-1)，2 μL Primer R，2 μL Primer F，0.2 μL KAPA Taq，1 μL gDNA和38.8 μL ddH2O。PCR程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃保溫7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用NEXTflexTMRapid DNA-Seq工具包構(gòu)建序列庫，并用HiSeq 2500進行測序分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

16S測序分析采用QIIME[17]進行質(zhì)量控制。質(zhì)控后的序列按照97%的相似性分別聚到一個操作分類單元(OTU)。此外，利用RDP Classifier[18]對OTUs進行分類學注釋。將具有代表性的序列系統(tǒng)分類到界、門、綱、目、科、屬、種的水平。

Alpha豐富度和多樣性分析包括ChaoI、ACE指數(shù)、Coverage、Shannon、Simpson指數(shù)。Beta多樣性分析，選取屬層次的菌落豐度結(jié)果，對樣本在屬

層次進行聚類，繪制Heatmap圖。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊瘤胃液細菌OTU數(shù)量和Alpha多樣性分析

綿羊瘤胃液細菌OTU數(shù)目和Alpha多樣性指數(shù)見表3。本試驗共得到919 539條有效序列，其中青貯組482 780條，發(fā)酵組436 759條；平均每個樣品有153 256條有效序列(57 567～299 253條不等)。所有序列按照97%相似性水平劃分成不同的聚類單元(OTU)，各個樣品得到的OTU數(shù)量差別很大(2 497～9 522個OTU不等)，平均序列長為292.04 bp。其中YD7的OTU數(shù)量最多(9 522)，其Alpha多樣性亦最高(ACE和ChaoI指數(shù)分別為10 201.40 和9 761.92)；YD0的OTU數(shù)量最少(2 497)，Alpha多樣性亦最低(ACE和ChaoI指數(shù)分別為3 365.31和3 450.48)。YS21與YD21的OTU數(shù)量相近，但YS21的Alpha多樣性指數(shù)更高。樣品的覆蓋率(Coverage)均在0.98以上，表明能夠較好地反映每個樣本中瘤胃細菌群落的組成和多樣性。

表3樣本OTU數(shù)量和Alpha多樣性

Table3OTUnumberandAlphadiversityofsamples

樣品Sample有效序列數(shù)Validsequence平均長度/bpAveragelength97%相似水平97%similaritylevelACEOTUsChaoICoverageSimpsonShannonYD072970292.383365.3124973450.480.98920.98938.4209YD7287336291.9610201.4095229761.920.99550.99429.6202YD21122474292.194533.0032814547.510.99130.97037.8876YS057567292.153514.6425723546.210.98560.99268.7884YS7299253292.056202.4248096201.110.99570.99198.9728YS2179939292.044349.4632784574.930.98750.99349.0130

2.2 綿羊瘤胃液細菌分類學組成

經(jīng)過分類學比對，6個樣品共鑒定得到29個門，74個綱，135個目，215個科，428個屬。

所有樣本均由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)4個優(yōu)勢菌門主導，其中others是豐度排名位于前20名以外的分類比例(圖1)。青貯組以擬桿菌門為優(yōu)勢菌群，其次為黏膠球形菌門、厚壁菌門和纖維桿菌門。發(fā)酵組亦以擬桿菌門為優(yōu)勢菌群，其次為厚壁菌門、黏膠球形菌門和纖維桿菌門。經(jīng)過21 d的飼喂，優(yōu)勢菌門在各組的豐度有所變化。青貯組的擬桿菌門從飼喂前的39.63%提高到42.46%，發(fā)酵組由42.20%提高到55.41%而后又回降到46.13%。作為第二優(yōu)勢菌門，黏膠球形菌門在青貯組增加了37.14%(由17.05%增加到23.38%)，在發(fā)酵組增加了22.59%(由11.38%增加到13.95%)。青貯組厚壁菌門從開始到試驗結(jié)束降低了36.04%，而發(fā)酵組變化甚微。擬桿菌門與厚壁菌門豐度之和在青貯組降低了4.66%(由54.53%下降到51.99%)，而在發(fā)酵組升高了6.92%(由56.64%提高到70.81%而后又降到60.56%)。纖維桿菌門豐度在青貯組增加了85.92%，而在發(fā)酵組只增加了30.75%，青貯組增加量大于發(fā)酵組。說明用發(fā)酵玉米秸稈替代青貯玉米秸稈飼喂綿羊?qū)α鑫肝⑸锝M成結(jié)構(gòu)具有很大影響。

其他菌門占所有序列的比例較低，但其中有些菌門也在飼料降解過程中起著重要的作用。如螺旋體門(Spirochaetae)可以有效降解纖維素、果膠和磷酸酯，發(fā)酵形成揮發(fā)性脂肪酸，為動物機體提供能量。趙圣國[19]研究發(fā)現(xiàn)，65.25%的脲酶是由瘤胃中變形門(Proteobacteria)類細菌產(chǎn)生，田雨佳[20]也進一步證實了瘤胃可以降解一些非蛋白氮源的研究結(jié)論。螺旋體門所占比例在青貯組降低了40.38%，而在發(fā)酵組中增加了13.07%。本研究發(fā)酵組YS21中變形菌門較青貯組YD21豐度更高，表明發(fā)酵過程中殘留的非蛋白氮可能較好地被利用了。

圖1 全樣本在門層次的菌落結(jié)構(gòu)Fig.1 Community structure histogram of all samples at phylum level

在屬水平上，共檢測到428個屬。其中，擬桿菌門理研菌科RC9腸道菌體屬(RikenellaceaeRC9 gut group)和普雷沃氏菌(Prevotella)、黏膠球形菌門中的RFP12腸道菌屬(LentisphaeraeRFP12 gut group)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)和食物谷菌屬(Victivallis)是所有樣品的優(yōu)勢菌屬(圖2)。Prevotella降解底物寬泛，飼喂21 d后，青貯組綿羊瘤胃液中Prevotella的豐度較飼喂前降低了69.77%，發(fā)酵組較飼喂前升高了68.05%，而Victivallis的豐度在兩組中的變化趨勢恰恰相反。LentisphaeraeRFP12 gut group和Fibrobacter的豐度在兩組中都有所增加，但青貯組增加的幅度大于發(fā)酵組。

除分解利用木質(zhì)纖維素外，多數(shù)瘤胃細菌還有降解粗蛋白的能力。瘤胃中主要的蛋白降解菌包括嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacteramylophilus)、棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella)和溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)。Prevotella是瘤胃中數(shù)量最多的蛋白分解菌。本研究中，Prevotella在發(fā)酵組YS7(相對豐度達到15.56%)時成為最優(yōu)勢菌屬，而在青貯組大大降低(相對豐度由10.48% 降低到3.17%)。而作為主要的瘤胃蛋白分解菌，丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)在兩組綿羊瘤胃液中豐度均小于1%。此外，厚壁菌門中的反芻獸新月形單胞菌屬(Selenomonas)在瘤胃除具有代謝乳酸的作用[21]外，同時還具有一定的蛋白降解活性。但其在兩組綿羊瘤胃液中的豐度均小于0.1%。

圖2 全樣本在屬層次的菌落結(jié)構(gòu)Fig.2 Community structure histogram of all samples at genus level

2.3 OTU組成分析

圖3為樣本基于前50個屬菌落豐度的Heatmap圖。Heatmap圖體現(xiàn)了6個樣品間的相似性和差異性。Prevotella在YS7的相對豐度最大，YD7和YS21次之，而在YD21的相對豐度最小。6個 樣品分成兩大簇，左邊4個樣品(YS7、YS21、YD7、YS21)聚成一大簇，右邊2個樣品(YD0和YS0)聚成一簇。其中，YS7和YS21、YD7和YD21各自聚成一小簇。結(jié)果證明，飼喂7 d后綿羊瘤胃內(nèi)細菌群落趨于穩(wěn)定，而飼喂不同營養(yǎng)組分的青貯和發(fā)酵玉米秸稈對綿羊瘤胃液的細菌群落多樣性的影響有一定的差異。

圖3 樣本在屬水平的菌落豐度Fig.3 Community abundance heatmap of samples at genus level

3 討 論

M.L.Sogin等[22]首次應用16S rDNA高通量測序技術(shù)對深海微生物群落進行了分析，近幾年該技術(shù)逐漸被應用到反芻動物瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)[23-25]的研究中。本試驗利用16S rDNA高通量測序技術(shù)對飼喂發(fā)酵玉米秸稈的綿羊瘤胃細菌多樣性進行研究。通過質(zhì)控共得到919 539條有效序列用于后續(xù)多樣性組成分析。各樣本瘤胃液稀釋曲線趨于平緩，表明測序深度已經(jīng)達到多樣性分析的要求，且樣本的覆蓋率均在0.98以上，表明焦磷酸測序庫能夠代表大部分的OTUs。兩組樣本Alpha多樣性差異較大，表明樣本間細菌數(shù)量及組成結(jié)構(gòu)上差異較大，且發(fā)酵組YS21較青貯組YD21擁有更高的Shannon和Simpson指數(shù)，以上結(jié)果均表明飼喂發(fā)酵玉米秸稈對瘤胃細菌的多樣性影響更大。

大多數(shù)研究報道，在門水平上擬桿菌門和厚壁菌門是反芻動物瘤胃內(nèi)的主要微生物菌群[26-27]，表明兩菌門在反芻動物瘤胃內(nèi)食物代謝的過程中具有重要作用。本研究發(fā)酵組得到了相同的結(jié)果，其中發(fā)酵組優(yōu)勢菌群是擬桿菌門，其次是厚壁菌門，這與R.Y.Zhang等[28]采用高通量測序技術(shù)研究不同飼草對奶牛瘤胃細菌組成和多樣性的結(jié)果一致。但本研究結(jié)果與S.E.Hook等[29]用高谷物飼糧飼喂奶牛瘤胃中厚壁菌門細菌占主導地位、擬桿菌門次之的結(jié)果相反，究其原因可能是我們采用的是高粗料飼糧。兩菌門豐度之和在發(fā)酵組呈升高趨勢，而在青貯組有所降低，表明低NDF粗料日糧能夠提高擬桿菌門和厚壁菌門在所有細菌菌群中的比例。本試驗青貯組黏膠球形菌門豐度遠高于發(fā)酵組，據(jù)報道黏膠球形菌門與纖維二糖的降解有關(guān)[30-31]，高含量的黏膠球形菌門可能歸因于青貯玉米秸稈中NDF等纖維類物質(zhì)含量高的緣故，這與R.Y.Zhang等[28]研究結(jié)果一致。與纖維降解有關(guān)的纖維桿菌門有著與其相似的變化趨勢，其在青貯組增加幅度遠超發(fā)酵組，這與D.W.Pitta等[16]報道的隨著日糧中纖維含量的增加纖維桿菌門的豐度亦增加的結(jié)果相一致。

在屬水平上，本試驗的差異主要是RikenellaceaeRC9 gut group(在青貯組增加了2.1倍)、Prevotella(發(fā)酵組增加了68%)、LentisphaeraeRFP12 gut group和Fibrobacter。Prevotella是瘤胃內(nèi)數(shù)量最為豐富的一類細菌[13,15]，可達瘤胃微生物總量的60%～70%[32]，能夠高效降解半纖維素[33]，有效利用植物非纖維多糖和蛋白質(zhì)[34]，并對淀粉、木聚糖和果膠的降解起重要作用[35]。D.J.Grilli等[36]在研究山羊從飼草到精料的轉(zhuǎn)變中瘤胃細菌多樣性的變化時發(fā)現(xiàn)，在飼喂高飼草的山羊瘤胃中Prevotella的豐度更高。據(jù)報道，D.W.Pitta等[16]用高粗蛋白的小麥秸稈飼喂肉牛發(fā)現(xiàn)，肉牛瘤胃液中Prevotella含量顯著增加。本研究中，Prevotella的相對豐度在發(fā)酵組更高，這與 I.S.Cunha等[37]報道的山羊瘤胃中Prevotella為優(yōu)勢菌屬結(jié)果相一致。

發(fā)酵玉米秸稈中的NDF等纖維素類物質(zhì)較青貯玉米秸稈顯著降低，故推斷青貯組綿羊瘤胃液中的纖維降解菌含量及豐度應更高，本研究恰恰證實了這一觀點。屬水平的群落結(jié)構(gòu)圖顯示，青貯組中具有纖維分解功能的纖維桿菌屬豐度升高幅度大于發(fā)酵組。但與劉大程等[38]研究發(fā)現(xiàn)的隨著粗飼料品質(zhì)的升高產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量有增加趨勢的結(jié)果相反。很可能與纖維降解有關(guān)的細菌，不僅與纖維降解菌有關(guān)還與其他菌有關(guān)，S.Koike等[39]就曾報道，纖維的降解在纖維降解菌與非纖維降解菌的相互作用下會加速。此外，高比例的未知分類的菌屬使飼草的評價很難進行，也體現(xiàn)了我們在綿羊瘤胃細菌組成知識方面的欠缺。但是，我們的結(jié)果基本上支持核心微生物組的概念。在本研究得到的29個門里，有14個門(相對豐度之和達到了99.5%以上)在所有樣本中被檢測到，這意味著他們在瘤胃內(nèi)飼料的降解中占有特殊的生態(tài)地位。

Heatmap圖證實了兩組樣本細菌組成的不同，這可能通過簡單的分類學注釋和Alpha多樣性不能明顯地比較出來?；谇?0個屬的菌落豐度Heatmap圖顯示，飼喂7和21 d后同組樣品聚在一起，然而不同細菌屬在不同樣本中呈現(xiàn)不同的豐度。說明飼喂7 d后，綿羊瘤胃液細菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，而飼喂等能等氮但NDF含量不同的日糧對綿羊瘤胃細菌區(qū)系具有較大影響。

4 結(jié) 論

4.1飼喂發(fā)酵玉米秸稈與飼喂青貯玉米秸稈對綿羊瘤胃細菌多樣性影響具有較大差異，且飼喂發(fā)酵玉米秸稈的瘤胃細菌多樣性更高。

4.2飼喂發(fā)酵玉米秸稈綿羊瘤胃液的擬桿菌門和厚壁菌門的豐度下降，而黏膠球形菌門和纖維桿菌門的菌群數(shù)量增加。

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