蒲思穎，鄭 杰，楊遠瀟，王 琴，楊繞芬，字向東

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是中國青藏高原及其毗鄰地區(qū)不可替代的重要畜種，是當(dāng)?shù)厝嗣褓囈陨娴纳a(chǎn)資料和生活資料。然而，與普通牛相比，牦牛產(chǎn)肉性能和泌乳性能都低下[1]。家畜育種是提高家畜生產(chǎn)性能的重要措施，但由于牦牛繁殖率低、世代間隔長[2]、產(chǎn)區(qū)育種基礎(chǔ)設(shè)施差、農(nóng)牧民育種意識淡薄，淘汰劣質(zhì)母牦牛的措施難以被農(nóng)牧民接受，因此，采用傳統(tǒng)育種手段開展牦牛育種工作難度大。超數(shù)排卵與胚胎移植(Multiple ovulation and embryo transfer, MOET)是以遺傳性能優(yōu)秀的母畜作為胚胎移植的供體，將其胚胎移植給生產(chǎn)性能低的母畜(受體)，繁殖出優(yōu)秀的后代。目前，MOET已成為綿羊、奶牛、肉牛育種的重要技術(shù)手段，使遺傳進展速度提高30%～76%[3]。如果將這項技術(shù)應(yīng)用于牦牛育種，可以實現(xiàn)在不大量淘汰劣質(zhì)母牦牛的條件下達到良種繁育的目的，有望成為容易被農(nóng)牧民接受的行之有效的牦牛育種技術(shù)。

胚胎超低溫冷凍保存使胚胎移植不受時間和地域的限制，是開展高效胚胎移植的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。目前，哺乳動物卵母細胞和胚胎的冷凍保存主要有傳統(tǒng)慢速冷凍(Conventional slow freezing)和玻璃化冷凍(Vitrification)兩種方法。后者具有操作簡便、冷凍損傷小、成功率高等優(yōu)點而被廣為采用[4-5]。然而，即便在胚胎冷凍保存技術(shù)研究最深入、應(yīng)用最普遍、冷凍胚胎移植妊娠率最高的畜種——普通牛，玻璃化冷凍胚胎的移植成功率一般也比鮮胚移植低10%以上[6-7]。雖然玻璃化冷凍影響胚胎發(fā)育的分子機制尚不完全清楚，但許多研究證明，玻璃化冷凍影響細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、發(fā)育、生物合成、呼吸以及應(yīng)激相關(guān)的基因表達，從而影響胚胎的后續(xù)發(fā)育能力[4-5]。目前，牦牛的胚胎移植尚處于起步階段[8-9]，卵母細胞和胚胎的冷凍保存是開展高效、商業(yè)化牦牛胚胎移植亟待解決的關(guān)鍵理論和技術(shù)。在牦牛卵母細胞冷凍保存方面開展過一些初步研究[10-12]，但玻璃化冷凍對牦牛胚胎的基因表達譜的影響還沒有深入研究。因此，本研究首次從轉(zhuǎn)錄組水平研究玻璃化冷凍對牦牛囊胚基因表達的影響，為探討牦牛囊胚冷凍損傷機制及完善冷凍方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牦牛囊胚的生產(chǎn)

在屠宰場采集的牦牛卵巢，從直徑為2～8 mm的卵泡中，抽取牦牛卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COC)，然后參照X. Xiao等[13]的方法開展牦牛卵母細胞體外成熟(IVM)。IVM液為含5 μg·mL-1FSH、50 IU·mL-1LH、1 μg·mL-117β-雌二醇和10% (v/v) 胎牛血清(FCS)的TCM199，在38.6 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)24 h。參照石仙等[14]方法，用Vitrolife(瑞典)體外胚胎生產(chǎn)系列試劑進行牦牛精子體外獲能、體外受精(IVF)及胚胎的體外培養(yǎng)(IVC)。

1.2 牦牛囊胚的玻璃化冷凍與樣品處理

IVF第6天收集囊胚，采用Kitazato公司的玻璃化冷凍試劑盒(VT101)、解凍試劑盒(VT102)，按照使用說明書上的步驟進行牦牛囊胚玻璃化冷凍與解凍。將解凍復(fù)蘇良好的3枚牦牛凍融囊胚混合獲得凍融囊胚組，將3枚發(fā)育良好的未進行冷凍處理的牦牛囊胚混合獲得新鮮囊胚組。分別將兩組囊胚在等滲、無鈣鎂離子的PBS溶液中清洗2～3遍，去除殘留血清和培養(yǎng)液。洗滌后，將囊胚分別移入含有細胞裂解液和RNase Inhibitor的兩個采集管中，在-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 Smart-seq2與轉(zhuǎn)錄組高通量測序

采用RNeasy Micro Kit提取新鮮囊胚和凍融囊胚樣本的總RNA，然后由安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司(Anoroad)使用Smart-Seq2方法[15-16]進行反轉(zhuǎn)錄：用反轉(zhuǎn)錄酶、含公共序列的Oligo-dT引物和TSO引物合成第一鏈cDNA；用ISPCR引物PCR擴增合成第二鏈cDNA。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別采用Qubit 2.0熒光儀(Life Technologies, USA)檢測cDNA濃度和Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies, USA)檢測cDNA片段分布和質(zhì)量情況。檢測合格的兩組樣本各取20 ng擴增產(chǎn)物cDNA作為起始原料進行文庫構(gòu)建。用 Bioruptor超聲破碎儀(Diagenode Inc, USA)進行樣本cDNA片段化，獲得長度約為200 bp的cDNA片段。cDNA片段經(jīng)末端修復(fù)、3′端加堿基A、測序接頭拼接等各步反應(yīng)后進行PCR擴增，用Beckman Ampure XP磁珠對PCR產(chǎn)物進行純化。最后用2%瓊脂糖凝膠分離出300～500 bp的DNA片段，回收目的片段，再溶于EB緩沖液中，即為最終的文庫。制備的文庫用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies, USA)和ABI Step One Plus適時PCR系統(tǒng)質(zhì)檢合格后，在HiSeq 2500測序平臺(Illumina, USA)用雙末端測序法進行高通量測序。

1.4 測序結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

對HiSeqTM2500測序所得的原始測序序列(Raw Reads)進行過濾，去除低質(zhì)量序列和測序接頭序列，得到干凈數(shù)據(jù)序列(Clean Reads)。采用TopHat v2.0.12軟件，將過濾后獲得的Clean Reads與牦牛參考基因組(BosGru_v2.0)[17]進行比對。根據(jù)RPKM法(Reads per kb per million reads)[18]計算基因表達水平。采用DEGseq法[19]，以|log2(凍胚/鮮胚)|≥1和Q<0.05作為閾值界定牦牛新鮮囊胚文庫和凍融囊胚文庫之間的差異表達基因(Differentially expressed gene, DEG)。將DEGs向Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)各個條目進行映射，以P<0.05為篩選條件，滿足條件的GO條目即為在DEGs中顯著富集的GO條目(GO term)。通過與KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進行比對，對基因涉及的信號通路進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

對HiSeqTM2500測序所得的Raw reads進行數(shù)據(jù)過濾后，得到新鮮囊胚文庫和凍融囊胚文庫的Clean Reads分別為48 455 410條和49 607 452條。將 Clean Reads 比對到牦牛的參考基因組，新鮮囊胚和凍融囊胚兩個文庫中分別有85.65% 和80.67% Clean Reads序列唯一比對到基因組(表1)。新鮮囊胚和凍融囊胚分別檢測到9 827個和13 567個轉(zhuǎn)錄本。

表1測序和比對結(jié)果概述

Table1AsummaryofRNA-seqandmappingresults

比對數(shù)據(jù)Mappeddata新鮮囊胚FRB凍融囊胚VTB原始序列數(shù)RawReads5195303655688790干凈數(shù)據(jù)序列數(shù)CleanReads4845541049607452比對上基因組的序列數(shù)MappedReads4150074240018948比對率/%Mappingrate85.6580.67Q30值/%Q30value90.1992.11轉(zhuǎn)錄本Transcript982713567

以|log2(凍胚/鮮胚)|≥1和Q<0.05作為篩選DEGs的閾值，共篩選得到兩個文庫之間有11 174 個DEGs，其中在凍融囊胚上調(diào)7 037個，下調(diào)4 137個 (圖1)。表2列出差異倍數(shù)最大的前10個上調(diào)基因和前10個下調(diào)基因。此外，與冷凍損傷相關(guān)的多數(shù)已知基因如氧化應(yīng)激(熱休克蛋白家族成員(HSP)、超氧化物歧化酶1(SOD1))、細胞凋亡(BCL2家族成員、死亡受體)、細胞周期(Cyclin B、組蛋白家族成員、聚合酶)的表達都發(fā)生顯著變化(表3)。

圖1 牦牛凍融囊胚和新鮮囊胚差異表達基因火山圖Fig.1 The volcano plot of DEGs of vitrified-thawed vs. fresh yak blastocysts

2.2 差異表達基因的Gene Ontology(GO)功能富集分析

將測序得到的DEGs與GO數(shù)據(jù)庫進行比對后，參考GO數(shù)據(jù)庫序列注釋測序基因。經(jīng)GO注釋分類后發(fā)現(xiàn)，牦牛新鮮囊胚和凍融囊胚共中有10 538 個DEGs顯著富集(P<0.05)到479條 GO terms上，其中生物過程(Biological process, BP)358條、細胞組成(Cellular component, CC)39條和分子功能(Molecular function, MF)82條。在BP分類中，細胞表面受體信號通路(Cell surface receptor signaling pathway cellular process)、刺激反應(yīng)(Response to stimulus)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)等GO terms富集水平最高；在MF分類中，信號受體活性(Signaling receptor activity)、跨膜信號受體活性(Transmembrane signaling receptor activity)和信號傳感器活性(Signal transducer activity)等GO terms富集水平最高；在CC分類中，膜內(nèi)特性(Intrinsic to membrane)、細胞外周(Cell periphery)和膜完整性(Integral to membrane)等GO terms富集水平最高(表4)。

表2差異倍數(shù)最大的前10個上調(diào)基因和前10個下調(diào)基因(Q值<0.05)

Table2Top10up-regulatedandtop10down-regulatedDEGs(Qvalue<0.05)withthegreatestfoldchanges

基因Gene登錄號GeneIDlog2(凍胚/鮮胚)*log2(VTB/FRB)*基因描述DescriptionTPM110227074415.7464原肌球蛋白1Tropomyosin1LOC10228589710228589715.5991谷氧還蛋白1Glutaredoxin-1LGALS310499421015.1938半乳凝(集)素3Galectin3LGALS110228226415.0754半乳凝(集)素1Galectin1CRIP157409314.8993富含半胱氨酸蛋白1Cysteinerichprotein1ACTG110552467514.8093肌動蛋白γ1Lactingamma1CLDN610228613914.7623Claudin蛋白6Claudin6LOC10226941910226941914.6898組織蛋白酶L1CathepsinL1PDPN10226877214.3215腎小球足突細胞膜黏蛋白PodoplaninTALDO151345313.9866轉(zhuǎn)醛醇酶TransaldolaseLEUTX102324018-14.1617亮氨酸二十同源LeucinetwentyhomeoboxCCL20102264450-13.5272C-C趨化因子配體模式20C-Cmotifchemokineligand20CD274102277853-13.4087CD274分子CD274moleculeSLC2A2102277237-12.6240SLC2A2溶質(zhì)載體家族2成員2 SLC2A2solutecarrierfamily2LOC102287557102287557-12.5559蛋白酪氨酸磷酸酶IVA型1ProteintyrosinephosphataseIVA1GIMAP7102390462-12.4676GTP酶家族的成員7GTPase,IMAPfamilymember7ZNF804A102279676-12.4350鋅指蛋白804aZincfingerprotein804aNOSTRIN102275938-12.2638一氧化氮合酶運輸介導(dǎo)物NitricoxidesynthasetraffickingXIRP2506090-12.1829肌動蛋白結(jié)合重復(fù)含2Xinactinbindingrepeatcontaining2HSD11B1102275244-12.105311β-羥類固醇脫氫酶1Hydroxysteroid11-βdehydrogenase1

*.凍融囊胚的基因表達量/新鮮囊胚的基因表達量。下同

*.VTB/FRB indicates gene expression of vitrified-thawed blastocystsvs. gene expression of fresh blastocysts.The same as below

表3冷凍機制相關(guān)的部分重要基因在胚胎玻璃化冷凍前后的表達情況

Table3Expressionsofsomeimportantgenesrelatedtofreezingmechanismpre-andpost-vitrification

表4差異表達基因前10富集的GO分類條目

Table4Top10enrichmenttermsofGOcategoriesofDEGs

GO分類GOcategoriesGO條目GOtermsGO_IDP值Pvalue基因Genes生物過程Biologicalprocess細胞表面受體信號通路Cellsurfacereceptorsignalingpathway00071667.40E-121363刺激反應(yīng)Responsetostimulus00508961.30E-073829信號轉(zhuǎn)導(dǎo)Signaltransduction00071652.50E-072438化學(xué)刺激反應(yīng)Responsetochemicalstimulus00422214.50E-071543信號Signaling00230525.40E-072677G-蛋白偶聯(lián)受體信號通路G-proteincoupledreceptorsignalingpathway00071865.80E-07300單細胞信號Singleorganismsignaling00447006.30E-072674系統(tǒng)過程Systemprocess00030081.00E-06687細胞通訊Cellcommunication00071542.00E-062730信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)Regulationofsignaltransduction00099664.30E-061229分子功能Molecularfunction信號受體活性Signalingreceptoractivity00380236.60E-11406跨膜信號受體活性Transmembranesignalingreceptoractivity00048882.00E-10358信號傳感器活性Signaltransduceractivity00048716.30E-10567分子傳感器活性Moleculartransduceractivity00600896.30E-10567受體活性Receptoractivity00048727.40E-10496G-蛋白偶聯(lián)受體活性G-proteincoupledreceptoractivity00049303.80E-07194門控通道活性Gatedchannelactivity00228361.90E-05140嗅覺受體活性O(shè)lfactoryreceptoractivity00049840.0003775配體門控離子通道活性Ligand-gatedionchannelactivity00152760.0004254配體門控通道活性Ligand-gatedchannelactivity00228340.0004254細胞組分Cellularcomponent膜內(nèi)特性Intrinsictomembrane00312249.10E-142676細胞外周Cellperiphery00719442.50E-132229膜完整性Integraltomembrane00160215.60E-132622細胞質(zhì)膜Plasmamembrane00058865.60E-132173細胞質(zhì)膜完整性Integraltoplasmamembrane00058872.20E-11518膜元件Membranepart00444252.30E-113287內(nèi)在質(zhì)膜Intrinsictoplasmamembrane00312263.10E-11544質(zhì)膜元件Plasmamembranepart00444596.90E-111044離子通道復(fù)合體Ionchannelcomplex00347026.50E-06120細胞外間隙Extracellularspace00056151.30E-05484

2.3 差異表達基因KEGG通路分析

對11 174個DEGs進行KEGG通路分析，結(jié)果顯示，DEGs被富集到真核生物的核糖體合成(Ribosome biogenesis in eukaryotes)、剪接體(Spliceosome)和神經(jīng)活性配體-受體互作(Neuroactive ligand-receptor interaction)等318條通路上，其中有8條顯著富集通路(表5)。

表5差異表達基因顯著富集的KEGG通路

Table5ThesignificantlyenrichedKEGGpathwaysintheDEGs

KEGG通路KEGGpathways差異表達基因DEGsQ值Qvalue通路編號PathwayID真核生物的核糖體合成Ribosomebiogenesisineukaryotes461.14E-05map03008剪接體Spliceosome741.14E-05map03040神經(jīng)活性配體-受體互作Neuroactiveligand-receptorinteraction793.03E-05map04080RNA轉(zhuǎn)運RNAtransport940.000249map03013RNA聚合酶RNApolymerase140.002076map03020核糖體Ribosome1520.024915map03010EB病毒感染Epstein-Barrvirusinfection1050.024915map05169化學(xué)致癌Chemicalcarcinogenesis400.024915map05204

3 討 論

胚胎移植是家畜育種的重要手段，而胚胎冷凍保存是胚胎移植的一個重要技術(shù)環(huán)節(jié)。在胚胎冷凍方法中，盡管玻璃化冷凍法具有操作簡便、成功率高等優(yōu)點，是目前各種家畜胚胎冷凍保存的主要方法[4-5]，但是，玻璃化冷凍胚胎移植后的妊娠率一般還是比鮮胚移植低10%以上[6-7]，然而其分子機制并沒有被完全揭示。牦牛的胚胎移植處于起步階段，目前尚未見牦牛胚胎冷凍保存的研究報道[8-9,20]。因此，本研究利用Smart-Seq2方法[15-16]分別對冷凍前后牦牛囊胚微量RNA進行反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建文庫并進行高通量測序研究。該技術(shù)能充分保持mRNA原有種類的復(fù)雜性，保證了擴增樣本的測序數(shù)據(jù)具有和原始未擴增富集樣本的測序數(shù)據(jù)的一致性[15]。

在牦牛新鮮囊胚和凍融囊胚中分別檢測到9 827 個和13 567個轉(zhuǎn)錄本，即低溫應(yīng)激導(dǎo)致凍融胚中新增3 740個轉(zhuǎn)錄本，其中多數(shù)與冷凍誘導(dǎo)的細胞凋亡、氧化應(yīng)激、熱休克和癌變等通路有關(guān)。例如，谷氧還蛋白(GLRX1)作為機體內(nèi)重要的抗氧化防御體系，對消除體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧 (Reactive oxygen species, ROS)引起的氧化應(yīng)激損傷具有重要的作用[21]。富含半胱氨酸蛋白1(CRIP1)作為腫瘤分子標志物，在多種腫瘤疾病中表達失調(diào)[22]，原肌球蛋白4(TPM4)也在腫瘤中表達[23]。高劑量的鈣結(jié)合蛋白S100A14可誘導(dǎo)細胞凋亡[24]。當(dāng)然，其中還有一些基因的功能有待進一步研究與完善。本研究還發(fā)現(xiàn)牦牛囊胚在玻璃化冷凍前后共有11 174個DEGs，其中冷凍后上調(diào)7 037個，下調(diào)4 137個(圖1)。在已有的研究報道中，皆沒有把本研究發(fā)現(xiàn)的前10個上調(diào)DEGs和前10個下調(diào)DEGs(表2)與胚胎冷凍應(yīng)激聯(lián)系起來，但經(jīng)過深入分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在冷凍前后的表達變化似乎都與冷凍應(yīng)激存在相關(guān)性。例如，在前10個上調(diào)DEGs中，原肌球蛋白1(TPM1)為腫瘤抑制蛋白，具有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[25]。半乳凝(集)素(LGALS3)能抑制胃癌細胞的衰老，從而加速胃癌的進程[26]，而Galectin 1則能誘導(dǎo)細胞凋亡[27]。CLDN6通過抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡，從而發(fā)揮抑制機體生長的作用[28]。組織蛋白酶L(Cathepsin L)與早期胚胎的細胞分裂活動有關(guān)[29]。在前10個下調(diào)DEGs中，亮氨酸二十同源(LEUTX)是胚胎基因組激活(Embryo genome activation, EGA)的候選基因，在EGA中發(fā)揮核心作用[30]。CD274分子 (CD274)表達量低的小鼠細胞不僅容易發(fā)生癌變，而且表現(xiàn)出癌干細胞系(CSC)的一些特征，包括醛脫氫酶(LDHA)活性高、ROS產(chǎn)量降低、細胞處于休眠狀態(tài)等[31]。組織缺氧誘導(dǎo)可以通過降低SLC2A2溶質(zhì)載體家族2成員2(SLC2A2)的表達而影響細胞功能[32]。F-BAR蛋白和一氧化氮合酶運輸介導(dǎo)物(NOSTRIN)參與FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管的發(fā)育[33]。冷凍前后胚胎轉(zhuǎn)錄組的這些顯著差異提示牦牛胚胎的玻璃化冷凍技術(shù)有待進一步完善。

冷凍應(yīng)激相關(guān)的已知基因在牦牛冷凍前后的表達差異基本與前人在其它物種的研究結(jié)果一致(表3)。硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)，通過抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)的功能而發(fā)揮介導(dǎo)氧化應(yīng)激、抑制細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡等作用[34]，細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK2)則調(diào)節(jié)細胞周期的啟動和進程[35]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)在凍融囊胚中，TXNIP表達顯著上調(diào)及CDK2表達顯著下調(diào)，說明冷凍對囊胚的存活有不利影響。與C. Monzo等[4]在人卵母細胞和N. Wang等[16]在牛卵母細胞玻璃化冷凍的結(jié)果類似，在玻璃化凍融牦牛囊胚中，與細胞周期相關(guān)的一些基因如APC15[36]和SYCE2[37]等基因的表達顯著下調(diào)。促進細胞凋亡的BAX基因的表達顯著上調(diào)，而抗細胞凋亡的BCL2基因的表達顯著下調(diào)，這些基因的表達變化可能導(dǎo)致凍融囊胚細胞凋亡加快，發(fā)育能力降低。耐冷性強的雜交稻和栽培稻通過提高劍葉的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性以及抗氧化劑抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)含量，有效地降低了ROS水平，減輕了低溫對生物膜的傷害[38]。本研究發(fā)現(xiàn)在牦牛凍融囊胚中，谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)、谷胱甘肽二硫化還原酶(GSR)和CAT等基因的表達量顯著提高，可能也是胚胎對溫度脅迫(玻璃化冷凍與解凍)的響應(yīng)。熱休克蛋白家族成員70(Heat shock proteins 70, HSP70)在正常細胞中水平較低，在低溫應(yīng)激狀態(tài)下可明顯升高，具有保護機體和細胞的功能[39]，因此，本研究中發(fā)現(xiàn)在牦牛凍融囊胚中HSPA8、HSPA5和HSPA9等HSP70家族成員中的基因表達上調(diào)，可能也是胚胎對溫度的響應(yīng)機制。

牦牛新鮮囊胚和凍融囊胚共中有10 538個DEGs顯著富集到479條GO terms上，其中生物過程(BP)358條、細胞組成(CC)39條和分子功能(MF)82條。在BP分類中，細胞表面受體信號通路、刺激反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等GO terms最為顯著富集；在MF分類中，信號受體活性、跨膜信號受體活性和信號傳感器活性等GO terms最為顯著富集；在CC分類中，膜內(nèi)特性、細胞外周和膜完整性等GO terms最為顯著富集(表4)。這與鄭杰等[20]用同樣方法在犏牛上開展研究獲得的結(jié)果相似，說明玻璃化冷凍對牦牛胚胎細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的不良影響可能是導(dǎo)致凍融囊胚發(fā)育能力降低的主要原因。KEGG通路分析結(jié)果顯示，

11 174個DEGs被富集到真核生物的核糖體合成、剪接體和神經(jīng)活性配體-受體互作等318條通路上，其中有8條顯著富集通路(表5)。該結(jié)果也與鄭杰等[20]在犏牛上的研究結(jié)果基本一致，推測牦牛囊胚可能主要通過真核生物的核糖體合成、剪接體和神經(jīng)活性配體-受體互作等代謝通路對玻璃化冷凍與解凍作出響應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究利用RNA-seq技術(shù)對玻璃化冷凍前后的牦牛囊胚進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)牦牛新鮮囊胚與玻璃化凍融囊胚之間有11 174個差異表達基因，顯著富集到479條 GO terms和8條代謝通路。這些結(jié)果為玻璃化冷凍對胚胎發(fā)育能力的影響機制提供了分子生物學(xué)證據(jù)，同時，也為進一步完善牦牛囊胚玻璃化冷凍與解凍技術(shù)提供了理論依據(jù)。

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