張正英，李世曉，楊萬(wàn)平，于安芬

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅五谷種業(yè)有限公司，甘肅 蘭州730070；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

采用多代自交選育自交系的玉米常規(guī)育種方法周期長(zhǎng)、成本高，通常需要自交6～8代，至少需要3 a以上時(shí)間。通過(guò)單倍體技術(shù)可將自交系選育時(shí)間縮短為1～2 a，大大加快育種進(jìn)程；而且雙單倍體系（DH系）完全純合，系內(nèi)變異來(lái)源于基因與環(huán)境互作，因而可以通過(guò)多點(diǎn)試驗(yàn)代替多年試驗(yàn)，更快速、更準(zhǔn)確和更可靠的評(píng)價(jià)雙單倍體系，提高育種效率。玉米單倍體雄穗育性自然恢復(fù)率低（一般1%～3%），有些材料甚至不發(fā)生自然加倍，受供體基因型的影響大[1]，自然加倍率很低，因此研究玉米單倍體的化學(xué)加倍方法來(lái)恢復(fù)雄穗育性就顯得尤為重要。秋水仙素是常用的染色體加倍藥劑，通常有很好的加倍效果。我們于2017年選取近期獲得的單倍體材料，通過(guò)苗期大田注射秋水仙素以提高玉米雙單倍體系的獲得率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試玉米單倍體 利用自有誘導(dǎo)系隴誘1號(hào)為父本，2016年經(jīng)誘導(dǎo)試驗(yàn)得到的不同種質(zhì)來(lái)源基礎(chǔ)群體單倍體材料10份。單倍體籽粒鑒定依據(jù)誘導(dǎo)果穗上擬單倍體籽粒R1-nj標(biāo)記，篩選籽粒頂部帶紫色標(biāo)記、胚尖不帶紫色標(biāo)記的擬單倍體籽粒作為供試材料。根據(jù)田間幼苗長(zhǎng)勢(shì)長(zhǎng)相判斷真實(shí)單倍體植株。

1.1.2 供試藥劑 供試藥劑為0.04%秋水仙素、2%二甲基亞砜（DMSO）。藥劑配方共3種，配方1為0.04%秋水仙素+2%二甲基亞砜（DMSO）；配方2為0.06%秋水仙素+2%二甲基亞砜（DMSO）；配方3（對(duì)照）為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種植方法 試驗(yàn)地設(shè)在景泰縣甘肅五谷種業(yè)有限公司育種基地。試驗(yàn)地為灰鈣土，土壤肥沃，灌溉便利。前茬玉米，冬水前施入羊糞45 000 kg/hm2，供試單倍體材料順序排列種植，行長(zhǎng)2 m，行距40 cm，株距25 cm。每份材料種植66株。其余管理同當(dāng)?shù)卮筇铩?/p>

1.2.2 處理方法 試驗(yàn)采用幼苗注射法。2017年春將擬單倍體籽粒逐粒播種于田間，幼苗5～6葉期時(shí)，用醫(yī)用1 mL注射器在生長(zhǎng)點(diǎn)上方約1 cm處刺入不同配方的藥劑。

1.2.3 鑒定及統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)各處理的幼（芽）苗數(shù)，即處理單倍體株數(shù)。根據(jù)苗期長(zhǎng)勢(shì)判斷真實(shí)單倍體植株。將長(zhǎng)勢(shì)瘦弱并且生長(zhǎng)緩慢，葉片較少、狹窄、直立上沖、葉色較淡的植株鑒定為真實(shí)單倍體。玉米植株抽雄后，觀察并記載單倍體植株的雄花育性恢復(fù)情況，將凡是具有外露花藥且能正常散粉的植株標(biāo)記為加倍株。

加倍率=散粉株數(shù)/單倍體植株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

秋水仙素兩種配方處理的加倍效果（表1）表明，配方2的加倍效果優(yōu)于配方1。配方1加倍率為2.3%～27.5%，平均加倍率10.99%；配方2的加倍率為6.5%～31.3%，平均加倍率17.47%；兩種配方的加倍效果均優(yōu)于空白對(duì)照，空白對(duì)照的加倍率為0～10.2%。經(jīng)成對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)測(cè)驗(yàn)，配方2加倍效果顯著優(yōu)于配方1，配方1加倍效果顯著優(yōu)于空白對(duì)照。說(shuō)明秋水仙素具有很好的加倍作用，劑量以0.06%秋水仙素+2%二甲基亞砜（DMSO）為優(yōu)。

3 小結(jié)與討論

玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)率低且受核基因型控制，一般難以自交結(jié)實(shí)，是影響玉米單倍體直接利用的關(guān)鍵因素。通過(guò)染色體加倍恢復(fù)其育性后，大大提高育種利用價(jià)值。經(jīng)過(guò)近50年的研究，玉米育種工作者在玉米單倍體的染色體化學(xué)加倍技術(shù)方面積累了一些經(jīng)驗(yàn)，并總結(jié)出一些比較有效的加倍方法，同時(shí)揭示了一些影響加倍效果的因子。魏昌松[1]比較了浸種法、浸芽法和注射法三種方法，以及不同濃度、不同處理時(shí)間下的秋水仙素加倍效果，認(rèn)為最優(yōu)的加倍方案是秋水仙素在濃度0.06%、0.08%時(shí)處理8～12 h。杜文平[2]研究表明，切根處理48 h，單倍體植株平均散粉率和結(jié)實(shí)率分別為51.39%和8.74%，極顯著高于直接浸根處理的散粉率和結(jié)實(shí)率。江禹奉等[3]研究表明大田中注射法散粉率為9.27%。

表1 玉米單倍體秋水仙素兩種處理方法的加倍效果

魏昌松等[4]認(rèn)為，不同基礎(chǔ)材料加倍率不同，XF1179×蘇1-51加倍株率可以達(dá)到35.90%。本研究中，單倍體材料6在2種配方處理下加倍率均很高，分別達(dá)到27.5%和31.3%，即使空白對(duì)照也達(dá)到10.2%。這些高加倍率材料可以采用自然加倍方法達(dá)到直接利用雙單倍體純系的目的。

自交率與雄穗散粉、雌穗吐絲的間隔期相關(guān)，反映了玉米單倍體雌穗育性恢復(fù)率和耐藥性，耐藥性高的材料一般具有較多的有利等位基因，加倍后從中篩選出抗逆性較強(qiáng)的雙單倍體材料的概率就更高。結(jié)實(shí)率反映了花粉與卵細(xì)胞的真實(shí)育性恢復(fù)率，也就是加倍藥劑滲透進(jìn)細(xì)胞、與微管相互作用以及在細(xì)胞中存留時(shí)間長(zhǎng)短的能力[5-6]。因此，應(yīng)該結(jié)合加倍株率、自交率和結(jié)實(shí)率三者來(lái)判斷化學(xué)藥劑和處理方法的加倍效果。本研究?jī)H通過(guò)統(tǒng)計(jì)雄穗散粉株數(shù)考察加倍率，還需要開(kāi)展更加細(xì)化的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]魏昌松.玉米單倍體高頻誘導(dǎo)系的篩選與加倍技術(shù)的研究[D].南京：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011.

[2]杜文平，余桂容，陳 謙.切根處理對(duì)玉米單倍體加倍效率的影響[J]. 玉米科學(xué)，2017，25（4）：12-16.

[3]江禹奉，覃蘭秋，程偉東，等.兩種環(huán)境下玉米單倍體注射法與自然加倍研究[J].玉米科學(xué)，2016，24（4）：20-23.

[4]魏昌松，許貴明，譚 澍，等.兩種藥劑對(duì)玉米單倍體加倍效果研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2016（3）：55-58.

[5]王曉梅，傅迎軍，孫殷會(huì).玉米單倍體誘導(dǎo)率及加倍率影響因素研究進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，4：151-155.

[6]周玉乾，寇思榮，連曉榮.不同生態(tài)區(qū)玉米單倍體自然加倍率研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2016（6）：5-7.