吉帥帥，莊翔麟，劉乃勇，2*

（1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)與利用學(xué)院，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

高度發(fā)達(dá)和極其靈敏的嗅覺系統(tǒng)在昆蟲覓食、交配、產(chǎn)卵、躲避天敵等行為活動中起著關(guān)鍵作用[1]。觸角是昆蟲嗅覺識別的重要器官，其表面著生有不同類型的感器，主要包括毛形感器、刺形感器、錐形感器和腔錐形感器等，它們在昆蟲的嗅覺感受過程中具有重要作用[2-3]。目前，較為認(rèn)同的一種嗅覺途徑是：氣味分子通過觸角感器表面的微孔進(jìn)入感器淋巴液，與淋巴液中的氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）結(jié)合并穿過神經(jīng)樹突中的水淋巴液，從而啟動后續(xù)一系列的嗅覺反應(yīng)，完成昆蟲對氣味分子的感受過程[4-6]。在這一過程中，OBP選擇結(jié)合特定類型的氣味分子，起著過濾器的作用[7]。

OBP是一類小分子的可溶性蛋白，分子量為15～30 kDa，一般多肽鏈全長120～160個氨基酸，N末端具有20個氨基酸左右的信號肽[8]。經(jīng)典OBP（classic OBP）具有6個保守的半胱氨酸殘基（cysteine，Cys），能夠形成3對二硫鍵，起穩(wěn)定蛋白三級結(jié)構(gòu)的作用。1981年，R.G.Vogt等[9]用標(biāo)記性信息素的方法，從多音大蠶蛾（Antheraea polyphemus）雄蛾觸角中發(fā)現(xiàn)昆蟲的第一個OBP，命名為性信息素結(jié)合蛋白（pheromone-binding proteins，PBPs）。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，多個昆蟲物種的OBP基因已經(jīng)得到鑒定，如在非鞘翅目昆蟲家蠶（Bombyx mori）[10]、梨小食心蟲（Grapholitha molesta）[11]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[12]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[13]中分別鑒定到 44、28、40、51 個 OBP 基因。在鞘翅目昆蟲紅棕象甲（Rhyncophorus ferrugineuss）[14]、紅脂大小蠹（Dendroctonus valens）[15]、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）[16]、松褐天牛（Monochamus alternatus）[17]、黃粉蟲（Tenebrio molitor）[18]、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）[19]、黃斑星天牛（Anoplophora nobilis）[20]中分別鑒定到 11、21、49、29、19、42、16個OBP基因。OBP在昆蟲不同組織的表達(dá)譜具有多樣性，不僅在觸角有表達(dá)，還在下唇須、頭部、胸、腹、足、翅、性腺等其他組織也有表達(dá)[21-22]。這說明昆蟲的OBP可能具有多種功能，包括嗅覺和非嗅覺功能，如研究發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅的OBP76a能夠感受求偶信息素 11-cis vaccenyl acetate（cVA）[23]；但是在桃蚜（Myzus persicae）中，OBP則被暗示參與翅型的分化[24]。

滅字脊虎天牛（Xylotrechus quadripes Chevrolat）屬鞘翅目Coleoptera，天牛科Cerambycidae，天牛亞科Cerambycinae，是嚴(yán)重危害咖啡的一種重要蛀干害蟲，廣泛分布在印度、中國、印度尼西亞、泰國、緬甸、越南等世界咖啡種植國家和地區(qū)，我國主要分布在云南、廣西、廣東、臺灣、福建等省。其中，在云南省該蟲主要分布在普洱、西雙版納、德宏、保山、臨滄等咖啡種植地區(qū)[25]。前人對滅字脊虎天牛的研究主要集中在蟲情調(diào)查、種群動態(tài)和發(fā)生規(guī)律等方面[26-29]，基于分子水平的研究相對較少，包括滅字脊虎天牛與寄主植物互作的分子機(jī)制方面的研究。隨著人們對綠色環(huán)保理念認(rèn)識的不斷提高，以及農(nóng)藥殘留和抗性引起的一系列問題，研發(fā)新型的害蟲防治技術(shù)已成為近年來農(nóng)林業(yè)害蟲控制的一種重要手段。其中，基于嗅覺的害蟲行為引誘劑或干擾劑已在鱗翅目等一些昆蟲中得到應(yīng)用，但在滅字脊虎天牛中尚未見報道有效的行為調(diào)控劑，OBP等嗅覺相關(guān)基因的鑒定可為基于反向化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究提供潛在分子靶標(biāo)[30]。本文對滅字虎天牛主要的化感器官——觸角進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，采用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定和研究了參與嗅覺感受的重要化感基因OBP家族，研究結(jié)果可為后續(xù)OBP的功能研究以及行為調(diào)控劑的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)昆蟲與組織收集

滅字脊虎天牛成蟲采自云南省瑞麗市，緯度N24°01′37.60″，經(jīng)度 E97°51′03.59″，海拔 783 m。野外解剖受害的咖啡樹干，將羽化5～7 d的滅字脊虎天牛雌雄成蟲分開，飼喂新鮮的咖啡木段。室內(nèi)將觸角、頭（無觸角）、胸、腹、足、翅分別收集至加有Trizol試劑的無RNA酶離心管中，每個組織收集2套生物學(xué)模板，存放于-80℃冰箱備用。

1.2 觸角RNA的提取及轉(zhuǎn)錄組測序

用Trizol法提取滅字脊虎天牛觸角總RNA，具體操作步驟見試劑盒說明書。采用Nanodrop檢測RNA純度（OD260/280比值），Agilent 2100檢測RNA的完整性。將檢測合格的滅字脊虎天牛觸角總RNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司構(gòu)建cDNA文庫并進(jìn)行RNA-seq測序。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集純化出mRNA，隨后加入fragmentation buffer將mRNA打成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成第二鏈cDNA，再用AMpure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行修復(fù)，加A尾并連接測序接頭，再用AMpure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMpure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進(jìn)行檢測，insert size符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度＞2 nmol/L），以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，利用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄本拼接和基因的功能注釋

測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量分析，去除帶接頭的序列、無法確定堿基信息的序列（比例大于10%）以及低質(zhì)量的序列后得到clean reads，以保證信息分析質(zhì)量。然后采用Trinity（版本：r20140413p1）對clean reads進(jìn)行拼接后形成最終的轉(zhuǎn)錄本。將每一條轉(zhuǎn)錄本在Blast nr庫中進(jìn)行比對，E-value≤1.0E-5認(rèn)為比對結(jié)果是可信的，最終獲得基因功能注釋的Unigenes。

1.4 基因的鑒定

采用BLAST同源搜索的方法，從滅字脊虎天牛的觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定OBP基因。首先，從NCBI（national center for biotechnology information） 數(shù)據(jù)庫中下載松褐天牛、云斑天牛（Batocera horsfieldi）、赤擬谷盜、華山松大小蠹（Dendroctonus armandi）、大猿葉蟲（Colaphellus bozoringi）的OBP基因作為靶標(biāo)序列，在BioEdit中采用Blast進(jìn)行同源性搜索，鑒定候選的OBP基因。然后，將所有OBP基因再次在NCBI nr中進(jìn)行比對，確定候選的OBP基因。根據(jù)氨基酸序列中保守Cys的數(shù)量和位置對OBP進(jìn)行分類：Classic OBPs有6個保守的Cys；Minus-C OBPs含有4個保守的Cys[8]。

1.5 序列分析

利用NCBI上的open reading frame finder（ORF finder）預(yù)測開放閱讀框（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。利用在線軟件 SingalP 4.1 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/SingalP）對OBP進(jìn)行信號肽預(yù)測及分析[31]。OBP序列之間的一致性利用Gene Doc進(jìn)行計算。序列比對采用ClustalX1.8.3。在系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建中，采用ClustalW進(jìn)行多序列比對，然后選取滅字脊虎天牛、松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛和黃斑星天牛共85個OBP序列，利用MEGA7.0軟件鄰位相連法（neighbour-joining）構(gòu)建進(jìn)化樹，對結(jié)果進(jìn)行1 000次Bootstrap驗(yàn)證[32]。

1.6 組織表達(dá)譜分析

收集不同組織時選取觸角20對、頭部（去除觸角）10個、胸10個、腹部10個、足和翅各30對（雌雄各組織按1∶1比例混合），分別提取各組織總RNA，利用DNase I去除各組織中的基因組DNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。選取滅字脊虎天牛肌動蛋白基因actin作為內(nèi)參基因，以檢測各組織cDNA模板質(zhì)量。采用RT-PCR研究OBP基因在以上各組織的表達(dá)情況。PCR條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，最后根據(jù)目的條帶的有無判斷OBP在不同組織中的表達(dá)情況。PCR所用特異性引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組分析及基因功能注釋

采用Illumina HiSeqTM2000測序平臺對滅字脊虎天牛成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序深度2.97 G，共獲得20 894 468個raw reads，去除接頭序列、污染序列及低質(zhì)量的序列后共獲得19784872個clean reads。利用Trinity軟件對過濾后的reads進(jìn)行從頭拼接，最終得到41 609個轉(zhuǎn)錄本（見表2）。通過GO數(shù)據(jù)庫共有11 610個Unigenes得到注釋，注釋到53個GO功能分類中。其中，生物過程（biological process）包含 25 個亞類，細(xì)胞過程（cellular process）所占比例最高，代謝過程次之；細(xì)胞組分（cellular component）包含18個亞類，細(xì)胞和細(xì)胞部分所占比例最高；分子功能（molecular function）包含10個亞類，結(jié)合功能所占比例最高（見圖1）。

表1 滅字脊虎天牛OBP基因表達(dá)譜分析所用引物Table 1 Primers used for expression patterns of OBP genes from X.quadripes

表2 測序結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Summary of sequence results

2.2 氣味結(jié)合蛋白基因的鑒定

通過同源性比對的方法，從滅字脊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到24個OBP基因。序列比對結(jié)果表明，OBP2、OBP3、OBP4、OBP6、OBP8、OBP10、OBP 21、OBP23和OBP24有6個保守的Cys，屬于Classic OBPs；OBP1、OBP5、OBP7、OBP9、OBP11-OBP20、OBP22有4個保守的Cys，屬于Minus-C OBPs。所有鑒定的OBP基因都具有完整的開放閱讀框，編碼123～180個氨基酸，且在N段具有一段長度不等的信號肽序列（16～23個氨基酸）。XquaOBPs的基本信息見表3。

2.3 氣味結(jié)合蛋白的序列及進(jìn)化分析

圖1 滅字脊虎天牛轉(zhuǎn)錄本的GO分類Figure 1 Gene ontology(GO)classification of X.quadripes transcripts with Blast2 GO program

表4 滅字脊虎天牛OBP序列一致性分析Table 4 Sequence identity analysis of X.quadripes OBPs

利用ClustalX1.8.3對滅字脊虎天牛24個OBP的氨基酸序列進(jìn)行對比，滅字脊虎天牛的OBP至少擁有4個保守的半胱氨酸Cys殘基（見圖2）。序列一致性分析表明，24個OBP間氨基酸差異性較大，一致性為 6%～81%（見表4）。其中XquaOBP5和Xqua OBP7一致性最高，為81%；XquaOBP12和XquaOBP 14一致性次之，為77%；而XquaOBP8和XquaOBP23的一致性最低，僅有6%。為了進(jìn)一步明確24個OBP之間的親緣關(guān)系，對其進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，XquaOBP5、OBP7、OBP9 和 OBP11-OBP20聚類到Minus-C OBPs進(jìn)化枝。XquaOBP1、OBP2、OBP3、OBP4、OBP6、OBP8、OBP10、OBP21、OBP22、OBP23和OBP24聚類到Classic OBPs進(jìn)化枝，但是序列比對結(jié)果顯示XquaOBP1和XquaOBP22為Minus-C OBPs亞家族。此外，我們進(jìn)一步構(gòu)建了XquaOBP與松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛和黃斑星天牛OBP的進(jìn)化樹。結(jié)果表明，滅字脊虎天牛OBP聚類到不同的分枝上，暗示它們可能有著不同的功能。XquaOBP1聚類到Classic OBPs進(jìn)化枝，但在序列結(jié)構(gòu)上屬于Minus-C OBPs亞家族（見圖3）。

圖2 滅字脊虎天牛OBP的序列比對Figure 2 Sequence alignment of X.quadripes OBPs

2.4 氣味結(jié)合蛋白的表達(dá)譜分析

采用RT-PCR技術(shù)，檢測了24個OBP基因在成蟲觸角、頭部（去除觸角）、胸、腹、足、翅中的表達(dá)。結(jié)果表明，XquaOBP4、OBP8、OBP18、OBP21 在觸角特異表達(dá)；XquaOBP2、OBP3、OBP7 和 OBP20在觸角高表達(dá)；其余OBP除在觸角表達(dá)外，還在其他組織中也有表達(dá)，如XquaOBP3在頭部和腹部表達(dá)，XquaOBP6頭部、腹部及翅表達(dá)，XquaOBP20在頭部、胸部、足及翅中表達(dá)，XquaOBP7、XquaOBP11-OBP17、XquaOBP19、XquaOBP22-OBP24 在檢測的所有組織中均有表達(dá)（見圖4）。

3 討論

近年來，國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室對昆蟲嗅覺基因進(jìn)行了大量的研究，研究對象主要集中在鱗翅目以及雙翅目的一些模式昆蟲、重要農(nóng)林業(yè)及衛(wèi)生害蟲[33]，而鞘翅目昆蟲的研究相對較少，天?？评ハx的研究更是鮮有報道，可能是由于該類昆蟲是一種鉆蛀性害蟲，野外采集和室內(nèi)飼養(yǎng)難度較大、室內(nèi)飼養(yǎng)周期長等原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)材料收集困難。如滅字脊虎天牛在普洱地區(qū)一年發(fā)生3代（3個成蟲羽化高峰期）[25]，每代均跨年度完成，世代重疊嚴(yán)重，同一代蟲態(tài)發(fā)育不整齊，成蟲羽化時間還易受氣候條件等因素的影響。而鱗翅目許多昆蟲如棉鈴蟲、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、小菜蛾（Plutella xylostella）等均可在室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，周期短且技術(shù)成熟，可以提供源源不斷的實(shí)驗(yàn)材料[34-37]。

圖3 滅字脊虎天牛和其他4種天牛OBP的鄰近樹Figure 3 Neighhor-joining tree of OBPs from X.quadripes and four other longhorned beetles

在天?？评ハx中，目前已有松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛以及黃斑星天牛嗅覺相關(guān)的OBP基因得到鑒定[18-20，38]。滅字脊虎天牛作為危害和制約咖啡產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種重要蛀干害蟲，本文對其嗅覺相關(guān)的OBP基因進(jìn)行了初步研究。首先，從觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定到24個OBP基因，該數(shù)量少于先前報道的鞘翅目其他昆蟲中OBP基因的數(shù)量，包括大猿葉蟲的26 個[39]、中歐山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）的31個[40]和赤擬谷盜的49個[16]，分析可能原因如下：①不同轉(zhuǎn)錄組測序深度存在差異；②滅字脊虎天牛OBP基因的鑒定來自于轉(zhuǎn)錄組，并非基因組數(shù)據(jù)。因此，滅字脊虎天牛的部分OBP基因可能仍未得到鑒定。

圖4 滅字脊虎天牛OBP基因在不同組織中的表達(dá)譜Figure 4 Expression pattern of OBPs in different tissues of X.quadripes

序列比對表明，XquaOBP1序列中有4個保守的Cys，從劃分上應(yīng)屬于Minus-C OBPs，但在Xqua OBP進(jìn)化分析中聚類到Classic OBPs分枝。Xqua OBP1 與黃斑星天牛 AnobOBP1、AnobOBP8、Anob OBP9進(jìn)化聚類分析結(jié)果類似，李廣偉等[20]認(rèn)為可能是黃斑星天牛的這3個OBP與Classic OBPs在進(jìn)化上更加同源或與這3個OBP相似性高的Minus-C OBPs沒有被鑒定。類似的情況很可能也出現(xiàn)在XquaOBP1中。鞘翅目不同OBP的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，滅字脊虎天牛24個OBP可分為2個亞家族：9個屬于 Classic OBPs家族，15個屬于 Minus-C OBPs家族。Minus-COBPs家族占OBP總數(shù)的62.5%。黃斑星天牛、松褐天牛、云斑天牛OBP中Minus-C OBPs分別占總數(shù)的68.8%、51.7%、60.0%。因此，在天?？莆锓N中Minus-C OBPs家族的基因數(shù)量均多于Classic OBPs，很可能是天?？评ハxOBP基因存在的一個普遍規(guī)律。

研究表明，XquaOBP4、OBP8、OBP18、OBP21 在觸角特異表達(dá)，推測其與滅字脊虎天牛尋找寄主或感受異性釋放的性信息素有關(guān)。其余OBP基因在除觸角以外的組織中有表達(dá)，很可能在滅字脊虎天牛生長發(fā)育過程中執(zhí)行非嗅覺功能。

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