廖曉霞，趙習(xí)彬，賴為民，謝 躍，楊光友，古小彬

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

兔癢螨病是由綿羊癢螨（兔亞種）（Psoroptes ovis var.cuniculi）寄生于兔的外耳道皮膚表面引起的一種慢性侵襲性傳染性皮膚病[1]。該病以螨蟲(chóng)抗原物質(zhì)引起的過(guò)敏反應(yīng)為特征，引起宿主皮膚表面滲出和炎癥、皮膚肥厚、瘙癢劇烈，使得皮膚嚴(yán)重?fù)p傷形成結(jié)痂，導(dǎo)致宿主體重下降，甚至造成死亡。

寄生蟲(chóng)感染宿主后，宿主皮膚會(huì)發(fā)生T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，其中輔助性T淋巴細(xì)胞（helper T cell，Th）處于核心位置，其可分為Th1、Th2、Treg和Th17等不同亞型細(xì)胞。其中Th1/Th2細(xì)胞平衡是維持正常細(xì)胞免疫和體液免疫所必需的，平衡失調(diào)則可能導(dǎo)致異常的免疫應(yīng)答。γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和白介素 4（interleukin 4，IL-4）分別是 Th1 和 Th2細(xì)胞的特征細(xì)胞因子[2]；同時(shí)，T細(xì)胞表達(dá)的T盒（T box expressed in T cells，T-bet）和 GATA 連接蛋白-3（GATA binding protein-3，GATA-3）分別是 Th1 和Th2細(xì)胞的特征轉(zhuǎn)錄因子[3]。有關(guān)研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3蛋白水平的變化可以間接反映Th1/Th2細(xì)胞在體內(nèi)的數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化及Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)水平[3-4]。同時(shí)，細(xì)胞因子IFN-γ及IL-4可通過(guò)雙向正反饋環(huán)，調(diào)控特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet與 GATA-3 的表達(dá)[2]。

疥螨病在內(nèi)的傳染性疾病均提示與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或輔助性T細(xì)胞分化的Th1、Th2和Th17有關(guān)[5]；綿羊感染綿羊癢螨的24 h內(nèi)表現(xiàn)出朝向Th2免疫應(yīng)答的趨勢(shì)[6-8]。本文旨在探討IFN-γ、IL-4與T-bet、GATA-3在不同病變程度的癢螨病患兔皮損組織中的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備

購(gòu)買80～100日齡、體重2.0～3.0 kg的健康新西蘭兔30只，隨機(jī)選擇其中22只新西蘭兔同時(shí)進(jìn)行人工感染綿羊癢螨（兔亞種）[9]，剩下的8只新西蘭兔作為陰性對(duì)照組。每只新西蘭兔飼養(yǎng)在單獨(dú)的籠子里，并且自由獲取食物和飲水，當(dāng)耳部癢螨感染病變?cè)u(píng)分達(dá)到1分、3分和5分（參照F.Guillot等[10]描述的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)）時(shí)，待用。

F.Guillot和 F.Wright的評(píng)分系統(tǒng)[10]：0 分，沒(méi)有結(jié)痂和螨蟲(chóng)；1分，耳道有少數(shù)結(jié)痂，有活癢螨；3分，耳道和1/4的耳郭存在結(jié)痂，有活癢螨；5分，耳道和3/4的耳郭存在結(jié)痂，有活癢螨。

1.2 耳部樣品采集

隨機(jī)選擇1.1中耳部病變達(dá)到1分、3分和5分的患兔各5只，作為患病組；選用5只健康新西蘭兔作為對(duì)照組（健康組/0分組）。具體組織樣品采集過(guò)程為：新西蘭兔稱重后，注射適宜的氯胺酮（1～2 mg/kg·W）進(jìn)行麻醉，頸動(dòng)脈放血處死后，用鑷子將耳部痂皮盡可能去除，用直徑為7 mm的環(huán)形皮膚采樣器采集患兔耳部皮損組織和健康兔同等位置的皮膚組織。一部分皮膚固定于4%多聚甲醛-0.1%磷酸鹽緩沖液固定液中，另一部分皮膚保存于液氮中，待用。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

取1.2中存于液氮中的約100 mg的耳部皮損組織置于組織研磨器中，加入0.9mL的PBS（0.01 mol/L，pH=7.4），研磨呈勻漿4℃下3000r/min離心10min，上清移入新的1.5 mL EP管中，-70℃凍存?zhèn)溆?。按照IFN-γ、IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）檢測(cè)皮膚組織勻漿中IFN-γ、IL-4的含量。結(jié)果用每毫克皮膚組織中有多少皮克細(xì)胞因子來(lái)表示（pg/mg）。

1.4 免疫組織化學(xué)

1.4.1 免疫組織化學(xué)染色

取1.2中存于4%多聚甲醛-0.1%磷酸鹽緩沖液中的耳部皮膚組織，按照常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋切片[11]。隨后進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟如下：5 μm切片脫蠟至水后在95℃的0.01 mol/L（pH 6.0）枸櫞酸緩沖液和0.5 mol/L（pH 8.0）EDTA緩沖液中分別進(jìn)行T-bet和GATA-3抗原的修復(fù)，隨后將切片放在3%H2O2溶液中25 min后用0.01 mol/mL PBS洗滌；滴加5%BSA封閉液室溫下放置40 min后，滴加相應(yīng)以1∶100稀釋的一抗（鼠T-bet IgG多克隆抗體，ab-91109，英國(guó)Abcam公司；山羊GATA-3 IgG單克隆抗體，sc-22206，美國(guó)Santa-Cruz公司）于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，37℃保溫1 h后PBS沖洗。隨后滴加相應(yīng)以1∶100稀釋的生物素二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，驢抗山羊IgG；武漢博士德生物工程有限公司）于37℃下放置1 h后PBS洗滌；滴加試劑SABC于37℃下放置1 h后PBS洗滌，使用DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）進(jìn)行顯色，并進(jìn)行復(fù)染，最后通過(guò)Nikon DS-U2/L2 Controler成像系統(tǒng)和 NIS-Elements F 3.22成像軟件（Nikon）進(jìn)行拍照。

1.4.2 結(jié)果判定及分析

陽(yáng)性結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞和細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行綜合判定，結(jié)果利用半定量法[12-13]進(jìn)行分析。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行觀察，利用Image-Pro plus軟件計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞。半定量法分析陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率和單個(gè)細(xì)胞染色強(qiáng)度。①陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率（R=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在每個(gè)所選區(qū)域所占比例）評(píng)分：R≤5%記為0分；5%＜R≤25%記為1分；25%＜R≤50%記為2分；50%＜R≤75%記為3分；R≥75%記為4分。②染色強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞無(wú)染色記為0分；細(xì)胞弱染色記為1分；細(xì)胞中度染色記為2分；細(xì)胞強(qiáng)染色記為3分。綜合陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分來(lái)得到樣本的最終結(jié)果：0分記為-；1～3分記為+；4～5分記為++；5分以上記為+++。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.5.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司）提取總RNA，并進(jìn)行RNA完整性、純度及濃度的檢測(cè)。隨后使用cDNA合成試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher科技公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-70℃待用。

1.5.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 中家兔 IL-4（DQ852343）、IFN-γ（AB010386）、GATA-3（XM008268070）、T-bet、（XM 008271373）、GAPDH（L23961）的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），由上海英濰捷基有限公司合成。

表1 IL-4、IFN-γ、GATA-3、T-bet、GAPDH 基因的引物序列Table 1 Primers sequences of IL-4、IFN-γ、GATA-3、T-bet、GAPDH genes

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)

本試驗(yàn)采用SYBR染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平，同時(shí)以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）進(jìn)行校正?？偡磻?yīng)體系20 μL：含SYBR Green Supermix 10μL，上下游引物10μmol/mL各0.4μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 7.2 μL。瞬時(shí)離心后，放入 Bio-Rad熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，和空白對(duì)照即將模板cDNA換為等體積的ddH2O。循環(huán)設(shè)置（兩步法）：95℃1 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s（GAPDH/IL-4/T-bet退火溫度為62℃，IFN-γ/GATA-3退火溫度為65℃），循環(huán)40次；于95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s得融解曲線。反應(yīng)完成后，即得到所有標(biāo)本的所有記錄點(diǎn)曲線。使用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)分析，調(diào)整基線后，計(jì)算達(dá)到閾值的最低循環(huán)數(shù)（Ct值）。標(biāo)本中的目的基因的mRNA拷貝數(shù)以Ct值來(lái)計(jì)算，并且每個(gè)基因測(cè)量均重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

IFN-γ、IL-4蛋白水平結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，并用GraphPad prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖；免疫組化所得數(shù)據(jù)通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)分析患病組（1分組，3分組，5分組）與健康組（0分組）間的差異顯著性；熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)通過(guò)Rest 2009和GraphPad prism 6.0軟件進(jìn)行分析和作圖。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ和IL-4蛋白的表達(dá)

IL-4蛋白的量從0分組的（0.135±0.003 63）pg/mg增加至 1 分組的（0.148 8±0.014 26）pg/mg，隨后減少至 3 分組的（0.131 6±0.006 22）pg/mg，并進(jìn)一步再減少至5分組的（0.117 2±0.003 49）pg/mg；患病組（1分組、3分組和5分組）皮損中IL-4蛋白較0分組均無(wú)明顯差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖 1a）。

從圖 1b可發(fā)現(xiàn)，與 0分組（0.344 2±0.014 33）pg/mg相比，3分組皮損中的IFN-γ蛋白呈顯著性增加（0.463 6±0.014 95）pg/mg，P＜0.05，但 1 分組（0.366 4±0.025 26）pg/mg和 5 分組（0.3482±0.04131）pg/mg的 IFN-γ蛋白增加不顯著（P＞0.05）。

圖1 在不同病變?cè)u(píng)分的癢螨病皮損組織中IL-4和IFN-γ蛋白的表達(dá)Figure 1 Expression of IL-4 and IFN-γ proteins in the different psoroptic mange lesion scores

2.2 GATA-3和T-bet蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)GATA-3和T-bet的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物均定位于細(xì)胞核。如圖2a所示（紅色箭頭所指），GATA-3蛋白的陽(yáng)性產(chǎn)物在0分組和1分組的細(xì)胞核上有所表達(dá)，而在3分組和5分組有很少且弱的表達(dá)；患病組（1分組、3分組和5分組）皮損處GATA-3蛋白較0分組均無(wú)明顯差異（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。此外，如圖2b所示（黑色箭頭所指），T-bet蛋白的陽(yáng)性產(chǎn)物在患病組（1分組、3分組和5分組）的細(xì)胞核中均有所表達(dá)，但患病組（1分組、3分組和5分組）皮損中T-bet蛋白較0分組均無(wú)明顯差異（P＞0.05）（見(jiàn)表 2）。

2.3 IFN-γ、IL-4、T-bet和 GATA-3 mRNA 的表達(dá)

從圖3可知，患病組（1分組、3分組和5分組）皮損中的IL-4 mRNA較0分組均無(wú)明顯差異（相對(duì)表達(dá)倍數(shù)：1分組/0分組=1.808，3分組/0分組=1.849，5 分組/0 分組=0.808；P＞0.05）。與 0 分組相比，3分組皮損中的IFN-γ mRNA呈顯著性增加（3分組/0分組=2.365，P＜0.05），而1分組和5分組皮損中的IFN-γ mRNA均無(wú)明顯差異（1分組/0分組=1.505，5 分組/0 分組=1.493；P＞0.05）。

患病組（3分組和5分組）皮損中的GATA-3 mRNA較0分組均顯著性減少（3分組/0分組=0.510，5分組/0分組=0.453；P＜0.05），而 1 分組皮損中GATA-3 mRNA差異不顯著（1分組/0分組=0.553，P＞0.05）；1 分組和 3 分組皮損中的 T-bet mRNA較0分組均顯著性增加（1分組/0分組=6.322，3分組/0分組=4.767；P＞0.05），而 5 分組皮損中的T-bet mRNA差異不顯著（5分組/0分組=3.515，P＞0.05）。

表2 在不同病變?cè)u(píng)分的癢螨病皮損中GATA-3和T-bet蛋白表達(dá)的比較Table 2 Comparison of GATA-3 and T-bet protein expression in the different psoroptic mange lesion scores

圖2 癢螨病皮損組織中GATA-3蛋白和T-bet蛋白的表達(dá)及定位（×200）Figure 2 The expression and location of GATA-3 protein and T-bet protein in lesion of psoroptic mange（×200）

圖 3 不同病變?cè)u(píng)分的癢螨病皮損中IL-4、IFN-γ、GATA-3、T-bet mRNA的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。Figure 3 The relative expression of IL-4、IFN-γ、GATA-3 and T-bet mRNA levels in the different psoroptic mange lesion scores

3 討論

癢螨感染宿主后會(huì)引起宿主寄生部位皮膚發(fā)生炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，主要以嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[14-17]浸潤(rùn)為主；而浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞則主要以T淋巴細(xì)胞為主[16]。其中Th細(xì)胞處于核心位置，其可分為Th1、Th2、Treg和Th17等不同亞型細(xì)胞。Th1/Th2細(xì)胞平衡是維持正常細(xì)胞免疫和體液免疫所必需的，平衡失調(diào)則可能導(dǎo)致異常的免疫應(yīng)答。Th1細(xì)胞可通過(guò)IFN-γ和腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor β，TNF-β）的產(chǎn)生發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，如果不加以控制，可能會(huì)導(dǎo)致組織的損傷和免疫病理學(xué)的發(fā)生；相反地，由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-4和IL-13則具有抗炎的作用，可預(yù)防疾病并緩解病情[18]。T-bet和GATA-3的相對(duì)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2的失衡，在一些免疫相關(guān)的疾病中均得到體現(xiàn)，如炎癥性腸道疾病、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和特異性皮炎[19-21]。然而，沒(méi)有任何研究報(bào)道過(guò)在不同病變?cè)u(píng)分的癢螨病中這些細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。因此，本部分檢測(cè)了不同病變程度的癢螨病患兔耳部皮損中Th1/Th2主要的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，為進(jìn)一步了解癢螨病的發(fā)病機(jī)制提供重要的依據(jù)，亦為尋求新的癢螨病防治措施奠定基礎(chǔ)。

癢螨病感染的早期階段已證實(shí)與Th2免疫反應(yīng)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)癢螨的早期感染過(guò)程中會(huì)有γδ T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞以及大量的嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)，但缺乏CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)[22]。綿羊感染癢螨24 h內(nèi)IL-4、IL-4R和IL-13的表達(dá)增加，亦揭示了癢螨病的早期階段會(huì)引起宿主發(fā)生Th2為主的免疫反應(yīng)[6]。在本研究中，1分組的患兔Th1細(xì)胞因子IFN-γ和轉(zhuǎn)錄因子T-bet較健康兔增加（IFN-γ mRNA：1分組/0分組=1.505，蛋白：0分組=0.344 2pg/mg，1 分組=0.3664 pg/mg；T-bet mRNA：1分組/0分組=6.322），Th2細(xì)胞因子IL-4亦增加而轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA則減少（IL-4 mRNA：1分組/0分組=1.808，蛋白：0分組=0.135 pg/mg，1分組=0.148 8 pg/mg；GATA-3 mRNA：1 分組/0 分組=0.553），表明此時(shí)的癢螨病患兔呈現(xiàn)混合型的Th1和Th2免疫反應(yīng)。3分組的患兔IFN-γ較1分組增加（IFN-γ mRNA：3分組/0分組=2.365，蛋白：3分組=0.463 6 pg/mg），而IL-4 mRNA有所增高，但蛋白水平卻有所降低（IL-4 mRNA：3分組/0分組=1.849，蛋白：3 分組=0.131 6 pg/mg）；T-bet和 GATA-3 mRNA水平均較1分組降低，但T-bet的水平明顯高于GATA-3的水平，表明3分的癢螨病患兔Th1免疫反應(yīng)較Th2免疫反應(yīng)更有優(yōu)勢(shì)。5分組患兔的2種細(xì)胞因子（IL-4和IFN-γ）和2種轉(zhuǎn)錄因子（GATA-3和T-bet）均較3分組時(shí)有所降低，但I(xiàn)FN-γ和T-bet水平均高于健康兔（IFN-γ mRNA：5分組/0分組=1.493，蛋白：5 分組=0.348 2 pg/mg；T-bet mRNA：5分組/0分組=3.515），而IL-4和GATA-3均較健康兔低（IL-4 mRNA：5分組/0分組=0.808，蛋白：5分組=0.117 2 pg/mg；GATA-3 mRNA：5 分組/0 分組=0.453），表明此時(shí)宿主的免疫反應(yīng)較3分時(shí)有所降低，但仍以Th1免疫反應(yīng)為主。由此可見(jiàn)，新西蘭兔在感染癢螨后，在早期評(píng)分較低的1分呈現(xiàn)混合型Th1/Th2免疫反應(yīng)，隨著癢螨數(shù)量的增加和結(jié)痂的增多評(píng)分達(dá)3分和5分時(shí)，Th2免疫反應(yīng)受到抑制，而Th1免疫反應(yīng)則有所增強(qiáng)。

新西蘭兔經(jīng)人工感染癢螨后，癢螨利用前肢附著于兔耳部皮膚，造成皮膚損傷，同時(shí)分泌毒素引起皮膚發(fā)炎和瘙癢，家兔用腳撓耳部導(dǎo)致皮膚破裂，滲出液流出混同脫落的上皮細(xì)胞、被毛及污垢混雜在一起形成結(jié)痂，感染后約15 d外耳道內(nèi)出現(xiàn)少量結(jié)痂達(dá)到評(píng)分1分，誘發(fā)宿主皮膚出現(xiàn)Th1細(xì)胞因子IFN-γ和轉(zhuǎn)錄因子T-bet以及Th2細(xì)胞因子IL-4的增高，呈現(xiàn)低水平的混合型Th1/Th2免疫反應(yīng)，不足以清除已有的癢螨；隨著癢螨不斷地繁殖數(shù)量的增多，炎癥加重，此時(shí)誘發(fā)宿主的免疫反應(yīng)以Th1為主，同時(shí)宿主的促炎性細(xì)胞因子IFN-γ增多（蛋白：1分組=0.366 4 pg/mg，3 分組=0.463 6 pg/mg），而抗炎因子IL-4降低（蛋白：1分組=0.148 8 pg/mg，3分組=0.131 6 pg/mg），從而進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥加重，炎性滲出物增多，使得宿主皮膚組織損傷愈加嚴(yán)重，皮損處產(chǎn)生更多的結(jié)痂，感染后約45 d兔的耳道和1/4耳郭出現(xiàn)結(jié)痂，評(píng)分達(dá)3分；隨著螨蟲(chóng)數(shù)量的繼續(xù)增加，誘發(fā)的以Th1為主的免疫反應(yīng)，無(wú)法抵御螨蟲(chóng)的寄生，從而導(dǎo)致皮膚損傷愈加嚴(yán)重，耳道和3/4的耳郭出現(xiàn)結(jié)痂，達(dá)到評(píng)分5分。

由此可見(jiàn)，癢螨病的早期，誘發(fā)宿主呈現(xiàn)Th1和Th2的混合免疫反應(yīng)，隨著病程的發(fā)展Th2免疫反應(yīng)逐步受到抑制，而Th1免疫反應(yīng)則逐漸增強(qiáng)，從而促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，使得宿主皮膚的損傷逐漸增強(qiáng)而達(dá)到高評(píng)分的病變。

參考文獻(xiàn)：

［1］ULUTAS B，VOYVODA H，BAYRAMLI G，et al.Efficacy of topical administration of eprinomectin for treatment of ear mite infestation in six rabbits［J］.Vet Dermatol，2005，16（5）334-337.

［2］HO I C，GLIMCHER L H.Transcription：tantalizing times for T cells［J］.Cell，2002，109（3）：109-120.

［3］RAY A，COHN L.Th2 cells and GATA-3 in asthma：new insights into the regulation of airway inflammation［J］.J Clin Invest，1999，104（8）：985-993.

［4］CHAKIR H，WANG H，LEFEBVRE D E，et al.T-bet/GATA-3 ratio as a measure of the Th1/Th2 cytokine profile in mixed cell populations：predominant role of GATA-3［J］.J Immunol Methods，2003，278（1-2）：157-169.

［5］BABU S，BHAT S Q，KUMAR N P，et al.Regulatory T cells modulate Th17 responses in patients with positive tuberculin skin test results［J］.J Infect Dis，2010，201（201）：20-31.

［6］BURGESS S T，F(xiàn)REW D，NUNN F，et al.Transcriptomic analysis of the temporal host response to skin infestation with the ectoparasitic mite Psoroptes ovis［J］.Bmc Genomics，2010，11（1）：624.

［7］BURGESS S T G，MCNEILLY T N，WATKINS C A，et al.Host transcription factors in the immediate pro-inflammatory response to the parasitic mite psoroptes ovis［J］.Plos One，2011，6（9）：e24402.

［8］BURGESS S T，GREER A，F(xiàn)REW D，et al.Transcriptomic analysis of circulating leukocytes reveals novel aspects of the host systemic inflammatory response to sheep scab mites［J］.Plos One，2012，7（8）：e42778.

［9］FISHER W F.Detection of serum antibodies to psoroptic mite antigens in rabbits infested with Psoroptes cuniculi or P ovis(Acari：Psoroptidae)by enzyme-linked immunosorbent assay and immunodiffusion［J］.J Med Entomol，1983，20（3）：257-262.

［10］GUILLOT F，WRIGHT F.Evaluation of possible factors affecting degree of ear canker and numbers of psoroptic mites in rabbits［J］.Southwest Entomol，1981，6（3）：245-252.

［11］劉世新.實(shí)用生物組織學(xué)技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2004.

［12］LEE Y K，HIPPE-SANWALD S，LEE S C，et al.Distribution of the interleukin-8 receptors，CXCR1 and CXCR2，in inflamed gut tissue［J］.J Pathol，2000，192（4）：533-539.

［13］ZHU K，YE J，MIAO W，et al.Expression of Th1 and Th2 cytokine-associated transcription factors，T-bet and GATA-3，in peripheral blood mononuclear cells and skin lesions of patients with psoriasis vulgaris［J］.Arch Dermatol Res，2010，302（7）：517-523.

［14］VAN DEN BROEK A，ELSE R，HUNTLEY J，et al.Early innate and longer-term adaptive cutaneous immunoinflammatory responses during primary infestation with the sheep scab mite，Psoroptes ovis［J］.J Comp Pathol，2004，131（4）：318-329.

［15］AMORIM M G R，DANTAS A F M，RIET-CORREA F.Histopathological alterations in psoroptic mange caused by Psoroptes cuniculi(Delafond，1859)in goats［J］.Semina-cienc Agrar，2015，36（3）：1425-1430.

［16］VAN DEN BROEK A，HUNTLEY J.Sheep scab：the disease，pathogenesis and contro［lJ］.J Comp Pathol，2003，128（2）：79-91.

［17］TEHRANI A，SADEGHIAN S，JAVANBAKHT J，et al.Studies of clinical and histopathological lesions resulting from Psoroptes cuniculli mange in domestic rabbits［J］.Biochem Cell Arch，2011，11（1）：221-226.

［18］D'AMBROSIO D，IELLEM A，COLANTONIO L，et al.Localization of Th-cell subsets in inflammation：differential thresholds for extravasation of Th1 and Th2 cells［J］.Immunol Today，2000，21（4）：183-186.

［19］ARAKAWA S，HATANO Y，KATAGIRI K.Differential expression of mRNA for Th1 and Th2 cytokine-associated transcription factors and suppressors of cytokine signalling in peripheral blood mononuclear cells of patients with atopic dermatitis［J］.Clin Exp Immunol，2004，135（3）：505-510.

［20］FINOTTO S.T-cell regulation in asthmatic diseases［J］.Chem Immunol Allergy，2008（94）：83-92.

［21］KAWASHIMA M，MIOSSEC P.mRNA quantification of T-bet，GATA-3，IFN-γ and IL-4 shows a defective Th1 immune response in the peripheral blood from rheumatoid arthritis patients：link with disease activity［J］.J Clin Immunol 2005，25（3）：209-214.

［22］AH V D B，HUNTLEY J F，MACKELLAR A，et al.Characterisation of lesional infiltrates of dendritic cells and T cell subtypes during primary infestation of sheep with Psoroptes ovis，the sheep scab mite［J］.Vet Immunol Immunop，2005，105（1/2）：141-150.