魯 花， 于 露， 甄歡歡， 劉汝銀， 岳宗進(jìn)

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院脊柱科， 河南 鄭州 450002)

腰椎間盤突出是以椎間盤退變?yōu)橹饕卣鞯囊环N常見病、多發(fā)病，也是腰腿痛的重要起因之一[1]。由于腰椎間盤的組織再生能力有限，退變后較難逆轉(zhuǎn)[2]。人腰椎間盤髓核細(xì)胞(human lumbar nucleus pulposus cells，HNPCs)是人體腰椎間盤髓核組織的唯一構(gòu)成細(xì)胞，嚴(yán)重影響著腰椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展[3]。腰椎間盤退變可直接導(dǎo)致髓核細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成減少[4]。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)作為傳統(tǒng)中藥人參的有效成分，具有促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生、提高神經(jīng)可塑性、抗衰老、提高免疫和輔助抗腫瘤等作用[5]。在體外，可通過細(xì)胞氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)來模擬體內(nèi)髓核細(xì)胞退變的微環(huán)境[6-7]。有報(bào)道證實(shí)，人參皂苷Rg1能通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)腦部缺血再灌注損傷[8]，提示其對(duì)病理?yè)p傷下的細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。但是，人參皂苷Rg1在HNPCs退變中是否也具有積極的保護(hù)作用尚不明確。因此，本文擬探究人參皂苷Rg1對(duì)退變HNPCs生長(zhǎng)和ECM合成的影響，并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制，以期為腰椎間盤突出患者的臨床治療在尋找新的藥物靶點(diǎn)方面提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 試劑和材料

HNPCs購(gòu)于ScienCell；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶等均購(gòu)于HyClone；人參皂苷Rg1購(gòu)于中國(guó)食品藥品鑒定研究院；LiCI購(gòu)于Sigma；CCK-8試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；Real-time PCR 試劑盒購(gòu)于Invitrogen；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司合成；Annexin V-FITC檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Trevigen；Caspase-3活性試劑盒和Western blot所用抗體均購(gòu)于Abcam；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Amersham。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和OGD模型的構(gòu)建 HNPCs培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)皿底細(xì)胞融合至80%時(shí)，用胰蛋白酶消化后按照3∶1的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。構(gòu)建HNPCs的OGD模型來模擬人體內(nèi)的腰椎間盤髓核細(xì)胞的退變微環(huán)境，將HNPCs培養(yǎng)基換為無血清的無糖DMEM培養(yǎng)基，于1% O2/ 94% N2/ 5% CO2氣體組分中培養(yǎng) 12 h。根據(jù)細(xì)胞分組，將LiCl以20 μmol/L 的濃度添加到培養(yǎng)基中用來激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。4 d左右第1次換液，每隔2 d換液1次，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始貼壁后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察。

2.2Real-time PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原(collagen II)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)和Ki67的mRNA水平 按照試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，collagen II的上游引物序列為5’-GCTCCCAGAACATCGCCTACC-3’，下游引物序列為5’-TGAACCTGCTATTGCCCTCT-3’；aggrecan的上游引物序列為5’-AGTCCTCAAGCCTCCTGTA-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCTCGCCAGTGTAG-3’，β-actin的上游引物序列為5’-GGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’，下游引物序列為5’-GGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’。按照試劑盒的說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 1 min、退火60 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，依據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.3Western blot檢測(cè)collagen II、aggrecan和Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將各組細(xì)胞按照每孔4×105的密度接種于6孔板，24 h后換液，進(jìn)行無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，各取30 μL 樣品進(jìn)行SDS-PAGE，再將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入I 抗為鼠抗人的collagen II、aggrecan、β-catenin、c-Myc、cyclin D1 和β-actin(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜。加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠 II 抗(1∶10 000)37 ℃ 孵育45 min，用 ECL液顯影，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)，隨后結(jié)果采用Image-Pro Plus 6軟件(Media Cybernetics)分析，以待測(cè)蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)的密度接種于96孔板中，用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h加入20 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)24 h，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。取5孔A值的平均數(shù)，按照下列公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力:細(xì)胞相對(duì)活力(%)=處理組A/對(duì)照組A×100%。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞按照每孔4×105個(gè)的密度接種到6孔板，12 h后換液，進(jìn)行24 h無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。預(yù)冷PBS洗滌，加入預(yù)冷75%乙醇，4 ℃固定4 h以上。離心棄上清，PBS洗滌后，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-EGFP孵育15 min，再加入5 μL propidium iodide (PI)混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15 min。1 h內(nèi)，在FC-500流式細(xì)胞儀上使用Beckman CXP軟件檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6Caspase-3試劑盒檢測(cè)caspase-3活性 將各組細(xì)胞按照每孔2×105的密度接種于96孔板中，12 h后換液，進(jìn)行24 h無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。按照說明書進(jìn)行操作，比色法測(cè)定caspase-3活性，用分光光度計(jì)在405 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組比較采用單因素方差分析，隨后各組均數(shù)間的兩兩比較通過SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 正常HNPCs和退變HNPCs的形態(tài)觀察

光鏡觀察結(jié)果顯示，正常HNPCs培養(yǎng)4 d左右大部分細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)多以類圓形和短梭形為主，胞質(zhì)豐富，突起呈現(xiàn)短而粗的特點(diǎn)；與HNPCs組相比，經(jīng)過OGD模擬的退變HNPCs在6 d后才發(fā)現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞突起延長(zhǎng)，形態(tài)為明顯的長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)減少且細(xì)胞生長(zhǎng)滯緩，見圖1。

Figure 1. The morphological changes of normal HNPCs and degenerative HNPCs observed under optical microscope (×100).

圖1正常和退變HNPCs的形態(tài)變化

2 人參皂苷Rg1促進(jìn)退變HNPCs中collagen II 和aggrecan的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細(xì)胞中特異性標(biāo)志物collagen II 和aggrecan表達(dá)均顯著減少(P<0.05)，而25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L人參皂苷Rg1可顯著增加collagen II 和aggrecan表達(dá)(P<0.05)。Western blot結(jié)果同樣顯示，不同劑量人參皂苷Rg1均可增加OGD組細(xì)胞collagen II 和aggrecan的蛋白表達(dá)，高劑量的人參皂苷Rg1作用效果最為顯著(P<0.05)，提示其可促進(jìn)OGD下細(xì)胞中ECM的合成，見圖2。

3 人參皂苷Rg1增加退變HNPCs的活性

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細(xì)胞活性明顯降低，而25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L人參皂苷Rg1可明顯升高OGD組細(xì)胞活性(P<0.05)，見圖3A。Real-time PCR結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細(xì)胞中增殖標(biāo)志蛋白Ki67的mRNA水平顯著減少，不同劑量人參皂苷Rg1均可增加OGD組細(xì)胞Ki67的mRNA表達(dá)，高劑量的人參皂苷Rg1作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖3B。

4 人參皂苷Rg1減少退變HNPCs的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細(xì)胞凋亡總數(shù)增加，而25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L人參皂苷Rg1可減少OGD組細(xì)胞凋亡比例(P<0.05)，見圖4A、B。Caspase-3試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細(xì)胞中的caspase-3活性顯著升高，不同劑量人參皂苷Rg1均可降低OGD組細(xì)胞caspase-3活性，高劑量的人參皂苷Rg1作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖4C。

Figure 2. The mRNA and protein expression levels of collagen II and aggrecan were detected by real-time PCR and Western blot analysis. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group.

圖2人參皂苷Rg1對(duì)退變HNPCs中collagenII和aggrecan表達(dá)的影響

Figure 3. Effect of ginsenoside Rg1 on the viability of degenerative HNPCs.A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B: the mRNA level of Ki67 was detected by real-time PCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group.

圖3人參皂苷Rg1對(duì)退變HNPCs活力的影響

5 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在人參皂苷Rg1改善HNPCs退變中的作用

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白均被顯著激活，100 μmol/L人參皂苷Rg1可有效降低β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白的表達(dá)，而給予Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl可逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rg1發(fā)揮的下調(diào)作用(P<0.05)，見圖5A、B。同樣的，在OGD組細(xì)胞中，LiCl可顯著緩解人參皂苷Rg1引起的細(xì)胞活力增加、細(xì)胞凋亡比例減少及collagen II 和aggrecan表達(dá)升高(P<0.05)，見圖5C～F。

討 論

人參是中國(guó)傳統(tǒng)中草藥，人參皂苷Rg1作為其主要的藥效成分，被證實(shí)是相對(duì)安全和有效的藥物，對(duì)正常的組織并無不良影響，因而被應(yīng)用于治療各種疾病[9]。人參皂苷Rg1藥理作用廣泛，特別是其可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，在腫瘤的治療方面具有較高的藥用價(jià)值[10]。近期文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，人參皂苷Rg1可劑量依賴性改善大鼠的神經(jīng)損傷癥狀，對(duì)受缺血再灌注損傷的大鼠腦部具有一定的保護(hù)作用[8]。已知體外細(xì)胞的OGD處理可模擬體內(nèi)的缺血再灌注損傷[11-12]，而且，體外OGD的HNPCs也可用來模擬退變HNPCs的微環(huán)境[6]，因此，本文擬探討人參皂苷Rg1是否對(duì)退變HNPCs有一定改善療效。

首先，在體外培養(yǎng)HNPCs并構(gòu)建OGD的HNPCs模型，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，證實(shí)OGD后的HNPCs細(xì)胞貼壁較晚，生長(zhǎng)緩慢， 形態(tài)由類圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，胞質(zhì)明顯減少，成功構(gòu)建退變HNPCs模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)和依據(jù)。腰椎間盤退變可顯著減少髓核細(xì)胞ECM的合成，而ECM主要由collagen II 和aggrecan構(gòu)成[1]。本文實(shí)驗(yàn)證實(shí)，基質(zhì)合成相關(guān)標(biāo)志分子collagen II 和aggrecan在OGD處理的HNPCs中顯著降低，而不同濃度的人參皂苷Rg1可明顯增加 collagen II 和aggrecan的表達(dá)，提示人參皂苷Rg1可促進(jìn)退變HNPCs的ECM合成。

Figure 4. Effect of ginsenoside Rg1 on the apoptosis of degenerative HNPCs.A: the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: the quantitative analysis of A; C: the caspase-3 activity was measured by a caspase-3 analysis kit. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group.

圖4人參皂苷Rg1對(duì)退變HNPCs凋亡的影響

Figure 5. Role of Wnt/β-catenin pathway in the inhibitory effect of ginsenoside Rg1 on degeneration of HNPCs.A: the representative images of the Western blot for determining the protein levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1; B: the quantitative analysis of A; C: the cells activity was measured by CCK-8 assay; D: the cells apoptosis was analyzed by flow cytometry; E: the protein expression of collagen II was determined by Western blot; F: the protein expression of aggrecan was determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group;&P<0.05vsOGD+100 μmol/L ginsenoside Rg1 group.

圖5Wnt/β-catenin信號(hào)通路在人參皂苷Rg1抑制HNPCs退變中的作用

細(xì)胞的增殖和凋亡是判斷細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的根本指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可增加退變HNPCs的活力，且增加增殖蛋白Ki67的表達(dá)，顯著促進(jìn)退變HNPCs的增殖。同時(shí)，人參皂苷Rg1可減少退變HNPCs的凋亡，降低caspase-3的活性，顯著抑制退變HNPCs的凋亡。這提示人參皂苷Rg1可有效促進(jìn)退變HNPCs的生長(zhǎng)，緩解其退變速度。

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育的關(guān)鍵途徑[13-14]。有文獻(xiàn)證實(shí)，激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路可引起椎間盤細(xì)胞的胞外基質(zhì)分解，抑制HNPCs增殖，誘導(dǎo)HNPCs凋亡，引發(fā)細(xì)胞退變[15]。本實(shí)驗(yàn)表明，退變HNPCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc和cyclin D1均表達(dá)上調(diào)，人參皂苷Rg1可顯著下調(diào)通路蛋白的表達(dá)，而通路激活劑LiCl可顯著扭轉(zhuǎn)人參皂苷Rg1抑制的Wnt/β-catenin的活化。除此之外，LiCl也可減弱人參皂苷Rg1對(duì)退變HNPCs生長(zhǎng)和ECM合成的影響。此結(jié)果提示，人參皂苷Rg1對(duì)退變HNPCs的生長(zhǎng)和ECM合成的調(diào)控很可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)。

本文證實(shí)，人參皂苷Rg1可通過負(fù)向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)退變HNPCs的生長(zhǎng)和ECM合成，從而有可能改善人腰椎間盤退變中髓核細(xì)胞的功能。因此，本研究將為延緩人腰椎間盤退變的治療提供一個(gè)新的方向。

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