黃 雪, 王 策, 陳 尚, 楊曉菲， 鄭媛媛, 王京波, 李富榮

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院， 深圳市人民醫(yī)院, 轉化醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心, 深圳市免疫細胞治療公共服務平臺， 廣東 深圳 510020)

惡性腫瘤是中國乃至全世界最重要的死亡原因，肺癌已經躍居發(fā)病率和死亡率第1位的腫瘤，目前最主要的治療手段還是手術、放療和化療。近年來免疫治療取得了突破性進展，如食品藥品監(jiān)督管理局批準程序性死亡受體1抗體Keytruda用于非小細胞肺癌的一線治療[1-2]。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是高度專職化的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)，不同成熟程度的DC具有不同的功能，不成熟的DC通過胞飲的方式來攝取抗原[3]，而分化成熟的DC能極大地刺激初始T細胞，識別腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)，從而對攜帶TAA的腫瘤細胞產生特異性的殺傷作用[4-6]。但在腫瘤患者體內樹突狀細胞的數(shù)量及機能都屬于低下水平，并不能夠很好的將腫瘤細胞清除[7]。

Toll樣受體3(Toll-like receptor 3, TLR3)在腫瘤微環(huán)境中的激活可以提高免疫細胞的抗腫瘤作用，聚肌胞苷酸[polyinosinic:polycytidylic acid,Poly(I:C)]是一種TLR3激動劑，能促進DC的分化成熟，并將抗原呈遞給T細胞，活化特異性的殺傷性T細胞，進一步誘導特異性的免疫應答[8-9]。已有文獻報道,TLR7/8激動劑咪唑喹啉類化合物R848與Poly(I:C)聯(lián)合應用比單一使用更能促進小鼠CD141+DC的分化成熟，這類DC比CD1c+DC呈遞抗原給CD8+T細胞的能力更強。不僅如此，TLR3/7/8激動劑刺激DC，會上調DC表面共刺激分子和趨化因子受體的表達[10-11]。因此，本研究擬將R848與Poly(I:C)聯(lián)合使用，誘導人DC分化成熟，并將腫瘤抗原遞呈給T細胞，觀察T細胞在體外特異性殺傷肺腺癌A549細胞的效果作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和耗材

AIM-V? CTSTM無血清培養(yǎng)基購于Life；人肺腺癌A549細胞系購于中國上海干細胞庫；PE標記的抗CD11c單抗、APC標記的抗CD86單抗、APC標記的抗CD80單抗和APC標記的抗CD83單抗購于BioLegend；胎牛血清購于Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基和PBS緩沖液購于HyClone；白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、人重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)ELISA試劑盒等購于PeproTech; R848和Poly(I:C)購于Sigma。

2 方法

2.1人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離、培養(yǎng)和鑒定 采集健康志愿者外周血肝素抗凝，經淋巴細胞分離液獲得PBMC，采用經典分化方案誘導其向DC分化[12]；在培養(yǎng)第5天加入A549細胞裂解物(即腫瘤細胞裂解物,tumor cell lysate, TCL;32 mg/L);第6天加入R848 (2.5 mg/L)和Poly(I:C)(25 mg/L)[13-14];第7天收集DC，在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學特征，用流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析DC表面分子的表達[15-16]。只加入TCL的DC為DC-TCL組，加入TCL和佐劑的DC為DC-R848+Poly(I:C)組，未加入TCL和佐劑的DC為DC-medium組。

2.2A549細胞裂解物的制備 培養(yǎng)A549細胞于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素)中，待細胞融合到80%～90%進行細胞傳代，收集處于對數(shù)期的A549細胞，計數(shù)，液氮和37 ℃水浴鍋中反復凍融5次，3 000 r/mim離心10 min，吸取上清即為TCL，BCA法測定蛋白濃度，在未加入任何佐劑的情況下，向DC培養(yǎng)基中加入不同蛋白濃度的TCL，通過檢測DC培養(yǎng)上清中的IL-12 p70的水平，篩選最佳抗原濃度[17]。

2.3FCM分析DC表面分子 收集經培養(yǎng)7 d后的DC，PBS洗滌后調整至1×109/L，各取100 μL細胞懸液，分別加入PE-CD11c單抗、APC-CD86單抗、APC-CD80單抗、APC-CD83單抗和APC-CD14單抗各10 μL，經過4 ℃孵育20 min，PBS洗滌2次，調整至1×109/L，F(xiàn)CM分析這些表面分子的表達[18]。

2.4細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的培養(yǎng) 利用密度梯度離心法從外周血中分離PBMC，貼壁2 h后收獲懸浮細胞即為T淋巴細胞[1]。將實驗分為3組,DC-R848+Poly(I:C)組、DC-TCL組和DC-medium組的DC分別與T淋巴細胞按1∶10的比例混合培養(yǎng)，加入IL-2、IL-15和IL-21(均20 μg/L);第3天予以半量換液處理并加添加上述細胞因子;第7天收獲細胞即為CTL。收集細胞上清液和細胞沉淀，通過ELISA檢測培養(yǎng)上清液IFN-γ和TNF-α含量。

2.5乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放實驗 為檢測CTL的細胞毒效應，取A549細胞為靶細胞，以每孔2×104的密度接種于96孔板中，貼壁4～6 h后去上清，接種上述各組的CTL，以5∶1、10∶1和20∶1為效靶比，1% NP-40為靶細胞最大釋放孔，16 h后于光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，拍照，離心5 min后，收集上清。LDH法檢測其殺傷作用[酶標儀測波長為492 nm處的吸光度(A)]，以下列公式計算效應細胞的殺傷活性[13, 19]。細胞殺傷率(%)=(實驗組A值-最小殺傷對照組A值)/(最大殺傷對照組A值-最小殺傷對照組A值)×100%。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用Prism統(tǒng)計作圖軟件分析處理，多組之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 DC的培養(yǎng)與表型鑒定

光學顯微鏡下觀察，成熟的DC可見典型的細胞突起，見圖1A;流式細胞術結果表明，90%以上的細胞表面有CD11c表達，見圖1B;經過R848聯(lián)合Poly(I:C)刺激的DC具有更長的細胞突起，見圖1C;經R848聯(lián)合Poly(I:C)刺激后CD83陽性表達率達80%以上，CD80陽性表達率達90%以上，而單核細胞的特征性標志CD14表達小于5%，DC-R848+Poly(I:C)組與DC-TCL組比較CD83和CD80表達明顯增加(P<0.05)，CD14表達顯著降低(P<0.05),各組之間CD86表達無明顯差異，見圖1D。

Figure 1. Identification of dendritic cells (DC). A: the morphological observation of DC (×400); B: the expression level of CD11c on the DC surface; C: characteristics of DC in different groups; D: CD80/CD83/CD86/CD14 expression on the DC surface in different groups. Mean±SD．n=3.*P<0.05vsDC-medium group;#P<0.05vsDC-TCL group．

圖1鑒別樹突狀細胞

2 篩選A549細胞裂解物作為抗原的最佳濃度

在未加入聯(lián)合佐劑的情況下，DC培養(yǎng)基中加入不同蛋白濃度的TCL，通過檢測DC上清中的IL-12 p70的水平，篩選出最佳抗原濃度為32 mg/L，見圖2。

3 R848和Poly(I:C)刺激后的DC培養(yǎng)上清中 IL-12 p70的含量

ELISA結果顯示，經過R848和Poly(I:C)刺激后，DC分泌IL-12 p70的量較DC-TCL組顯著增加，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖3。

Figure 2. IL-12 p70 level in the culture supernatant of DC treated with different concentrations of antigen was tested by ELISA. Mean±SD．n=3．**P<0.01vs0 mg/L.

圖2ELISA法檢測經過不同濃度的抗原處理后DC培養(yǎng)上清液中IL-12p70的含量

Figure 3. IL-12 p70 level of each group was detected by ELISA. Mean±SD．n=3．**P<0.01vsother groups.

圖3ELISA法檢測培養(yǎng)7d后DC培養(yǎng)上清液中IL-12p70的含量

4 抗原致敏DC誘導的CTL對A549細胞的特異性殺傷效果

LDH釋放實驗顯示,效靶比為10∶1和20∶1時，DC-R848+Poly(I:C)組CTL對A549細胞的殺傷率明顯增高(P<0.01)，而DC-medium組與DC-TCL組之間無明顯差異;當效靶比為5∶1時，各組CTL對A549細胞的殺傷作用無明顯差異，見圖4。

Figure 4. Cytotoxicity was tested by LDH assay. Mean±SD．n=3．##P<0.01vsother groups.

圖4檢測不同效靶比的效應T細胞對靶細胞的殺傷能力

5 DC與T細胞共培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α的水平

ELISA結果表明，經DC-R848+Poly(I:C)組DC與T細胞共培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α含量與DC-medium和DC-TCL組相比均顯著升高(P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The levels of IFN-γ(A) and TNF-α(B) in the co-culture (7 d) supernatant of DC and T cells (1∶10) detected by ELISA. Mean±SD．n=3．**P<0.01vsother groups.

圖5DC與T細胞(1∶10)共培養(yǎng)7d后檢測細胞上清中IFN-γ和TNF-α的水平

討 論

在肺癌中非小細胞肺癌占85%，其中腺癌占50%以上。由于早期肺腺癌不易發(fā)現(xiàn)及晚期患者由于轉移耐藥等原因，5年生存率不足15%[20]。近年來免疫靶向治療發(fā)展迅速，為肺癌的治療帶來了曙光[21]。

DC是最有效的抗原呈遞細胞。未成熟的DC抗原攝取能力強，通過內吞作用捕獲外源性的抗原，釋放到其細胞質間隔中；成熟的DC抗原呈遞能力增強，并經過主要組織相容性復合體I類抗原呈遞途徑，呈遞給CD8+T細胞，并誘導產生腫瘤抗原特異性的CTL，在免疫治療中發(fā)揮重要作用[18, 20, 22]。

機體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其中T細胞的作用尤為關鍵。CTL的主要組織相容性I類復合體有腫瘤來源的多肽，這樣就能夠鎖定并激活和它結合的T細胞抗原受體，使T細胞增殖并產生抗腫瘤特性[23]。經過抗原刺激的DC能將抗原呈遞為表位的小分子，以抗原肽的形式與CD8+T細胞的主要組織相容性I類復合體相結合，并且T細胞能識別DC表面共刺激分子CD80(B-7.1)和CD86(B-7.2)信號，由此DC活化了T細胞，誘導T細胞產生特異性的細胞毒作用。成熟活化的T細胞通過分泌炎性細胞因子發(fā)揮特異性的抗腫瘤效應，IFN-γ和TNF-α是最主要的抗腫瘤炎性因子[4]。在本實驗中，通過R848和Poly(I:C)刺激后的DC可誘導T細胞成為CTL，使CTL發(fā)揮對A549細胞的特異性殺傷作用，并隨著效靶比的提高而增強，CTL分泌IFN-γ和TNF-α的能力也較DC-TCL組和DC-medium組顯著提高。

TLR激動劑能改變抗原的物理性狀，延緩抗原降解，從而增強DC對抗原的攝取和呈遞能力，更有效刺激淋巴細胞的增殖和分化。理想的佐劑須安全且無長期毒副作用。R848是一種咪唑喹啉類化合物，為水溶性合成小分子，可以通過TLR7/TLR8-MyD88依賴性信號通路活化免疫細胞[8],由于其內毒素含量很低，不影響正常細胞的生理功能。Poly(I:C)是TLR3激動劑，能促進DC成熟、趨化遷移和促炎細胞因子的產生[24]?；谖墨I報道，目前仍然缺少致敏DC的特異性的抗原，全細胞裂解物含有最廣譜的抗原，可能是刺激DC抗原遞呈的最佳抗原[25-26]。

本研究結果顯示，經過R848和Poly(I:C)的刺激后的DC，其表面分子CD11c、 CD80和CD83表達明顯升高，而單核細胞的特征性標志CD14表達小于5%。IL-12 p70是腫瘤免疫中很重要的免疫啟動因子，DC是分泌IL-12 p70最主要的免疫細胞，IL-12 p70的分泌能激活NK細胞和CTL的免疫活性。經過R848和Poly(I:C)刺激后的DC，其上清中IL-12 p70的含量可達300 ng/L以上，顯著高于DC-TCL組和DC-medium組，而DC-TCL組和DC-medium組的IL-12 p70水平無明顯差異。這是由于病原體相關分子模式是通過結合DC表面特定受體來增強其抗原呈遞能力的，單使用TCL不足以刺激DC抗原交叉呈遞作用，無法有效活化初始T細胞。研究表明TLR激動劑結合DC表面受體，是形成DC抗原呈遞電位的有效佐劑[27-28]。

本研究也發(fā)現(xiàn)，經過R848和Poly(I:C)刺激后的DC致敏效應T細胞中CD4+/CD25+/Foxp3+Treg細胞的數(shù)量減少，并刺激產生了分泌IFN-γ的腫瘤抗原特異性CD8+T細胞。據(jù)文獻報道，TLR4激動劑單磷脂酰A、TLR9激動劑CpG、TLR4激動劑LPS等也能刺激DC分化成熟[24, 29]。本課題組也將對其它TLR激動劑進行研究。本實驗發(fā)現(xiàn)R848和Poly(I:C)對DC刺激后，DC的表面成熟分子顯著上調，將抗原遞呈給T細胞，經刺激后的DC誘導的T細胞分泌TNF-α和IFN-γ能力顯著提高(P<0.01)，而DC-TCL組和DC-medium組T細胞分泌TNF-α和IFN-γ能力無明顯差異，且R848和Poly(I:C)刺激后的DC可明顯提高致敏T細胞對肺腺癌A549細胞的殺傷效果。

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