孫麗靜，張 哲，劉 茜，胡夢(mèng)蕓，張穎君，呂亮杰，李 輝

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100)

細(xì)胞分裂素是一類(lèi)經(jīng)典的植物激素，參與了許多植物發(fā)育過(guò)程，在細(xì)胞分裂、調(diào)控頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)芽的分化、葉綠素的合成、延緩開(kāi)花時(shí)間及葉片衰老、促進(jìn)維管束分化和種子發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[1-9]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，在植物應(yīng)對(duì)鹽、干旱等非生物脅迫的過(guò)程中，細(xì)胞分裂素也扮演著重要的角色[10-16]。

細(xì)胞分裂素的信號(hào)是通過(guò)由細(xì)胞分裂素受體組氨酸激酶(Histidine kinases，HKs)、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Histidine phosphotransfer proteins，HPs)以及反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(Response regulators，RRs)組成的復(fù)雜的雙元組分系統(tǒng)(Two component system，TCS)進(jìn)行傳遞的[17-18]。細(xì)胞分裂素與受體HK胞外域的CHASE(Cyclaseand histidine kinase-associated sensing extracellular)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使受體胞內(nèi)域保守位點(diǎn)His自磷酸化，之后磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體接受域保守的Asp位點(diǎn)。接下來(lái)，磷酸基團(tuán)再轉(zhuǎn)移到HP上保守的His位點(diǎn)并促使HP由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。最后，磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到定位于細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子B型RR接受域保守的Asp位點(diǎn)上，從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[19-20]。

組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在擬南芥中由6個(gè)成員組成，其中，AHP1～AHP5含有發(fā)揮功能的保守His磷酸化位點(diǎn)，是有功能的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[21]。AHP6中保守的His磷酸轉(zhuǎn)化位點(diǎn)被Asp替代，不具備傳遞磷酸基團(tuán)的功能[22]。水稻中的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族由5個(gè)成員組成：2個(gè)OsAHP和3個(gè)OsPHP[23-24]。OsAHP1和OsAHP2均具有保守的XHQXKGSSXS序列及其中保守位點(diǎn)的His，該位點(diǎn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可以接受來(lái)自組氨酸受體激酶的磷酸基團(tuán)，進(jìn)而將磷酸基團(tuán)傳遞給下游的響應(yīng)因子。因此，保守位點(diǎn)的His對(duì)于OsAHP行使信號(hào)傳遞的功能是必需的。而在OsPHP中該保守位點(diǎn)的His被Gln替代，因而無(wú)法進(jìn)行信號(hào)傳遞，從而被稱(chēng)為假組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。擬南芥和水稻中的研究結(jié)果顯示，組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同時(shí)也參與了植物對(duì)鹽和干旱脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[21，25]。

目前，小麥中已經(jīng)克隆了3個(gè)組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，分別為T(mén)aHP1、TaHP2和TaHP3[26]，但是并未對(duì)其在逆境脅迫下的表達(dá)和功能開(kāi)展研究。本研究克隆了一個(gè)新的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為T(mén)aHP4，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并研究了其在小麥不同組織及逆境脅迫下的表達(dá)特征，旨在為深入研究和利用該基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及逆境脅迫處理

小麥科農(nóng)199由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供。取抽穗期小麥的根、莖、葉和穗，3次重復(fù)。取樣后迅速置于液氮中冷凍并于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培10 d的小麥幼苗，分別進(jìn)行干旱(20% PEG-6000)、200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和50 μmol/L BA處理，于0，1，3，6，12，24 h取相同部位葉片，3次重復(fù)。取樣后迅速置于液氮中冷凍并于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物總RNA的提取及cDAN合成 用TRNzol Reagent(TIANGEN)按試劑說(shuō)明書(shū)提取植物總RNA。以500 ng RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 小麥TaHP4基因的克隆 利用擬南芥組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AHP1(At3g21510)、AHP2(At3g29350)、AHP3(At5g39340)、AHP4(At3g16360) 和AHP5(At1g03430)基因序列分別比對(duì)小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//plants.ensembl.org)，得到多個(gè)可能的小麥HP基因部分cDNA序列，通過(guò)電子克隆拼接得到1個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為T(mén)aHP4。根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，上游引物TaHP4-F：5′-GTCTCATTGCA

GCCATCTCAG-3′，下游引物TaHP4-R：5′-TAGCTGG

TCCCTTAGTTCCCT-3′，由北京英駿生物公司合成。PCR反應(yīng)使用Premix PrimeSTAR HS(TaKaRa)，體系為50 μL：Premix PrimeSTAR HS(2×)25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL，小麥cDNA 2 μL，超純水18 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，68 ℃ 35 s，32個(gè)循環(huán)；68 ℃ 7 min。使用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，切膠回收后連接至pEASY-Blunt Cloning載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆后測(cè)序。

1.2.3 小麥TaHP4基因序列分析 序列的ORF分析、蛋白質(zhì)翻譯、分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)使用OMIGA軟件；利用ProSite(http：//prosite.expasy.org/)在線(xiàn)分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析。包括以下組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因：小麥中的TaHP1 (AY342358)、TaHP2 (BK005644)和TaHP3 (BK005645)，擬南芥中的AHP1 (At3g21510)、AHP2 (At3g29350)、AHP3 (At5g3934)、AHP4 (At3g16360)、AHP5(At1g03430)和AHP6(At1g80100)，水稻中的OsAHP1(Os08g44350)、OsAHP2 (Os09g39400)、OsPHP1 (Os01g54050)、OsPHP2 (Os05g09410)和OsPHP3(Os05g44570)，玉米中的ZmHP1(AB024293)、ZmHP2(AB024292)、ZmHP3(AB089191)和ZmHP4(NM_001153941)。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 利用Primer Express軟件設(shè)計(jì)目標(biāo)基因qRT-PCR引物。上游引物TaHP4-QF：5′-TGAAGCAGAAGCTGGAGTCAT-3′，下游引物TaHP4-QR：5′-TGGTCCCTTAGTTCCCTTGG-3′。以小麥TaActin為內(nèi)參，上游引物TaActin-QF：5′-TGCTATC

CTTCGTTTGGACCTT-3′，下游引物TaActin-QR：5′-AGCGGTTGTTGTGAGGGAGT-3′。用SYBR?Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，20 μL 反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板(稀釋10倍)4 μL，ddH2O 4.4 μL。反應(yīng)在Bio-Rad Icycler iQ5 Real-time PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)性重復(fù)，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)確定每個(gè)基因和樣本相應(yīng)的Ct值，以TaActin為內(nèi)參基因，將“0”時(shí)間點(diǎn)樣本的表達(dá)量設(shè)為“1”，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaHP4基因克隆及序列分析

根據(jù)拼接的TaHP4基因序列，設(shè)計(jì)了上下游引物，從小麥幼苗的cDNA中擴(kuò)增得到了一條長(zhǎng)度為563 bp的序列(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，其核苷酸序列與電子克隆的序列一致，包含一個(gè)456 bp的ORF，編碼151個(gè)氨基酸，推測(cè)的蛋白分子量為17.71 ku，等電點(diǎn)為9.09。TaHP4具有一個(gè)HPt結(jié)構(gòu)域，位于第38-133個(gè)氨基酸，其中第79位His為保守的磷酸化組氨酸位點(diǎn)，該位點(diǎn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可以接受來(lái)自組氨酸受體激酶的磷酸基團(tuán)，進(jìn)而將磷酸基團(tuán)傳遞給下游的響應(yīng)因子。

2.2 TaHP4蛋白的同源序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析

將TaHP4預(yù)測(cè)的氨基酸序列與來(lái)自小麥、擬南芥、水稻和玉米中的18個(gè)HP蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)(圖2)，結(jié)果顯示，TaHP4與水稻和玉米中不含保守His位點(diǎn)的HP同源性較高，其中與水稻中的OsPHP2同源性最高，達(dá)到了88.7%，其次為OsPHP1、ZmHP4和OsPHP3，同源性也達(dá)到了62.3%～68.9%；而與擬南芥、水稻和玉米中含保守組氨酸位點(diǎn)的HP同源性較低，僅為36.5%～55.9%；與小麥中已經(jīng)克隆的3個(gè)HP的同源性也只有32.2%～34.2%。以上結(jié)果表明，TaHP4是一個(gè)新的小麥組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。

MⅢ. Marker Ⅲ分子量標(biāo)準(zhǔn)；TaHP4. TaHP4基因擴(kuò)增結(jié)果。MⅢ. Marker Ⅲ DNA Marker；TaHP4. Gene amplification of TaHP4.

圖2 小麥TaHP4與其他HP氨基酸序列比對(duì) Fig.2 Multiple amino acid sequences alignment of TaHP4 and other HPs

將TaHP4預(yù)測(cè)的氨基酸序列與來(lái)自小麥、擬南芥、水稻和玉米中的18個(gè)HP蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析(圖3)，結(jié)果顯示，TaHP4與水稻、玉米和擬南芥中不含保守His位點(diǎn)的OsPHP1、OsPHP2、OsPHP3、ZmHP4、AHP6和含保守His位點(diǎn)的AHP4位于同一個(gè)進(jìn)化分枝，小麥中前期已經(jīng)克隆的TaHP1、TaHP2、TaHP3與水稻和玉米中的含保守His位點(diǎn)的OsAHP1、OsAHP2、ZmHP1、ZmHP2和ZmHP3位于同一個(gè)進(jìn)化分枝，擬南芥中含保守His位點(diǎn)的AHP1、AHP2、AHP3和AHP5位于同一個(gè)進(jìn)化分枝。

圖3 小麥TaHP4與其他HP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 Fig.3 Phylogenetic tree of TaHP4 and other HP proteins

2.3 TaHP4基因的表達(dá)特性

為了解TaHP4基因在小麥不同組織的表達(dá)特性，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行了熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，TaHP4在根、莖、葉和穗中都有表達(dá)，但不同組織的表達(dá)水平存在顯著差異(圖4)。其中，葉中表達(dá)量最高，其次是穗和莖，而在根中的表達(dá)量最低。

為了進(jìn)一步了解TaHP4在小麥各種脅迫下的表達(dá)特性，對(duì)小麥幼苗進(jìn)行鹽、干旱、脫落酸和細(xì)胞分裂素處理，并利用基因特異引物進(jìn)行了熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，鹽(NaCl)和干旱(PEG)脅迫時(shí)，TaHP4表達(dá)量在1 h就明顯降低，3 h達(dá)到最低值，之后表達(dá)量開(kāi)始回升，但至處理24 h，表達(dá)量仍顯著低于處理前水平(圖5-A、B)。脫落酸(ABA)處理時(shí)，TaHP4表達(dá)量在1 h就降低至最低值，之后表達(dá)量持續(xù)維持在較低水平(圖5-C)。細(xì)胞分裂素(BA)處理時(shí)，TaHP4表達(dá)量從1 h開(kāi)始持續(xù)下降，至12 h降至最低水平，24 h仍保持在較低水平(圖5-D)。

圖柱上不同字母表示組織間在0.05水平上差異顯著。圖5同。Values followed by different letters are significantlydifferent at the 0.05 probability level.The same as Fig.5.

圖5 TaHP4在各種脅迫處理下的相對(duì)表達(dá)量 Fig.5 Relative expression of TaHP4 under various treatments

總之，TaHP4基因的表達(dá)受鹽、干旱、脫落酸和細(xì)胞分裂素抑制表達(dá)，可能在小麥抵御非生物脅迫的過(guò)程中具有重要作用。

3 討論與結(jié)論

為了克隆小麥細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并研究其表達(dá)特性，本研究通過(guò)電子克隆結(jié)合RT-PCR的方法，得到一個(gè)小麥HP基因TaHP4。生物信息學(xué)分析顯示，該基因ORF長(zhǎng)456 bp，編碼的蛋白長(zhǎng)度為151個(gè)氨基酸，具有一個(gè)HPt結(jié)構(gòu)域和一個(gè)負(fù)責(zé)磷酸基團(tuán)傳遞的保守的His位點(diǎn)；蛋白序列同源比對(duì)分析顯示，TaHP4與小麥中已經(jīng)克隆的3個(gè)HP的同源性只有32.2%～34.2%，表明TaHP4是一個(gè)新的小麥HP基因。然而，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，TaHP4與水稻、玉米和擬南芥中不含保守His位點(diǎn)的OsPHP1、OsPHP2、OsPHP3、ZmHP4、AHP6位于同一個(gè)進(jìn)化分枝，而與小麥中前期已經(jīng)克隆的TaHP1、TaHP2、TaHP3位于不同的進(jìn)化分枝，暗示其在小麥細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中可能發(fā)揮著獨(dú)特的作用。

不同的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因有不同的組織表達(dá)模式。一些HP基因在不同組織組成型表達(dá)，如玉米中的ZmHP2[27]。另一些HP基因具有特異的組織表達(dá)模式，如擬南芥中的AHP1、AHP2和AHP3基因主要在根中表達(dá)，在葉片和莖中的表達(dá)量則很低[28]；小麥中的TaHP1在地上部的表達(dá)量很高，而在根中則幾乎不表達(dá)[26]。本研究中的TaHP4基因表達(dá)模式與TaHP1類(lèi)似，在葉、穗、莖等地上部表達(dá)量較高，而在根中表達(dá)量則很低。

擬南芥中的研究表明，細(xì)胞分裂素負(fù)調(diào)控著植物應(yīng)對(duì)鹽、干旱等非生物脅迫的過(guò)程，降低植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素水平或減弱細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均能夠提高植物對(duì)鹽、干旱等非生物脅迫的耐受性[29-34]。擬南芥中組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AHP2、AHP3和AHP5均受鹽、干旱和ABA抑制表達(dá)，其三重突變體ahp2，3，5對(duì)鹽和干旱的耐受性也顯著高于野生型對(duì)照[25]。然而，水稻中組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鹽和干旱脅迫中卻發(fā)揮著不同的功能。OsAHP1和OsAHP2受干旱抑制表達(dá)，其RNAi植株對(duì)干旱的耐受性也顯著高于野生型對(duì)照；相反，OsAHP1受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，其RNAi植株對(duì)鹽的耐受性也顯著低于野生型對(duì)照[35]。本研究中的TaHP4基因與擬南芥中AHP2、AHP3和AHP5類(lèi)似，受鹽、干旱和ABA抑制表達(dá)，表明其參與了小麥響應(yīng)上述3種逆境脅迫的生物學(xué)過(guò)程，但其具體功能還需要更多分子遺傳學(xué)的證據(jù)。

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