溫金明，石曉東，高潤梅，戎丹仁，柳昱旻

(山西農(nóng)業(yè)大學 林學院，山西 太谷 030801)

1943年，Marker研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元是合成甾體激素藥物的原料，薯蕷屬(DioscoreaL.)植物的開發(fā)利用便在全世界范圍內(nèi)迅速展開，目前，全球甾體激素類藥物多于60%以薯蕷皂苷元為原料[1]。我國對薯蕷植物資源的開發(fā)利用始于20世紀50年代，國內(nèi)含薯蕷皂苷元的根狀莖植物有17種1亞種3變種，其中，盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC. H. Wright)和穿龍薯蕷(DioscoreanipponicaMakino)的薯蕷皂苷元含量較高、品質(zhì)較好[2-7]。盾葉薯蕷是我國的特有種，主要分布于長江流域，在南方多省區(qū)已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但薯蕷皂苷元產(chǎn)量仍難以滿足工業(yè)需要，供求矛盾突出[5，8-9]。所以，在我國北方地區(qū)發(fā)掘與薯蕷皂苷元相同藥用成分的其他植物資源，是解決甾體藥物原料供應的重要課題。

穿龍薯蕷在我國主要分布于山西、陜西、東北等地區(qū)，多生于海拔100～1 700 m的稀疏雜木林內(nèi)和山腰河谷兩側的山坡灌木叢中及林緣[10]。其根莖入藥歷史悠久，有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用，治療類風濕性關節(jié)炎、冠心病、心絞痛、慢性氣管炎、慢性布魯菌病、脂肪瘤等療效較好[11]。穿龍薯蕷根莖中薯蕷皂苷元含量為0.93%～2.26%，但受土壤、水分、溫度、光照等環(huán)境因子的影響，各產(chǎn)地的藥材質(zhì)量存在差異[12-14]。因此，篩選高含量的種質(zhì)對于穿龍薯蕷的栽培具有重要意義。傳統(tǒng)的種質(zhì)篩選方法是對所有種質(zhì)皂苷含量進行測定分析，盲目性較大，且費時費力費財，不利于大規(guī)模篩選。葉片特征對于盾葉薯蕷種質(zhì)篩選和保存具有一定的指導意義，根據(jù)葉片形態(tài)對薯蕷種質(zhì)進行粗篩，無疑能加快高含量種質(zhì)篩選的進程。已有研究表明，三角葉薯蕷(DioscoreadeltoideaWall.)的薯蕷皂苷元含量與葉片的長度、寬度呈正相關[15]；寬葉型盾葉薯蕷的薯蕷皂苷元含量較長葉型植株含量高[12，16]；盾葉薯蕷葉的葉綠素含量與光合速率正相關，光合速率越強，光合產(chǎn)物含量越大，根狀莖產(chǎn)量越高，薯蕷皂苷元含量越高[17]。

本試驗以山西省蟒河和關帝山2個種源地的穿龍薯蕷植株為研究對象，分析穿龍薯蕷葉片的形態(tài)多樣性特征，比較不同葉形的葉綠素與光合產(chǎn)物的含量，以期探討葉形態(tài)與光合產(chǎn)物間的相關性，為穿龍薯蕷的良種選育工作提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試種源分別取之于山西省蟒河自然保護區(qū)和關帝山龐泉溝自然保護區(qū)。

1.2 試驗地概況

蟒河自然保護區(qū)(112°22′10″～112°31′35″E，35°12′30″～35°17′20″N)位于晉城市陽城縣境內(nèi)，海拔300～1 572 m，年均降水量600～900 mm，年均溫14 ℃，無霜期180 d，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候[18]。

關帝山龐泉溝自然保護區(qū)(37°20′～38°20′N，110°18′～111°18′E)位于呂梁山中段，處于交城、方山兩縣之間，海拔1 300～2 800 m，年均降水量約820 mm，年均溫4.3 ℃，無霜期180 d，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候[19]。

1.3 試驗方法

2014年9-10月分別于試驗種源地采集穿龍薯蕷部分地下根莖，沙藏越冬至2015年4月，取出根莖植于山西農(nóng)業(yè)大學林學院苗圃，常規(guī)水肥管理。2017年5月，選取2個種源地長勢旺盛的穿龍薯蕷植株，按照葉色、葉裂數(shù)等葉部形態(tài)的差異，選取180枚成熟葉片，進行葉形態(tài)測量和生理指標測定。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 葉形態(tài)指標測量 采用EPSON Scan掃描儀獲取葉片的數(shù)字圖像，利用 Image J軟件分別測量葉長(葉基到葉尖的長度)、葉寬(垂直于葉柄方向的葉片最寬處)、葉面積和葉張角(葉基部夾角)[20]。人工數(shù)取葉裂數(shù)，計算葉片長寬比。為了分析的便利，對葉張角進行分級：Ⅰ. 葉張角<40°；Ⅱ. 40°≤葉張角<50°；Ⅲ. 50°≤葉張角<60°；Ⅳ. 60°≤葉張角<70°；Ⅴ. 葉張角≥70°。

1.4.2 葉生理指標測定 葉綠素含量測定采用直接浸提法[21]，可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍染色法[22]，可溶性糖和淀粉含量的測定采用蒽酮比色法[22]，還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸法[23]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行方差分析和相關分析，差異水平為0.05；采用Excel 2013進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 穿龍薯蕷葉形態(tài)多樣性分析

測量計算穿龍薯蕷的葉長、葉寬、長寬比、葉面積、葉裂數(shù)和葉張角等形態(tài)指標，并就葉形態(tài)差異和指標之間的相關性進行分析。

2.1.1 葉形態(tài)差異 穿龍薯蕷葉形態(tài)多樣性明顯，表現(xiàn)在葉色深淺、葉長、葉寬、葉裂、葉張角等方面，結果如表1所示。

表1 穿龍薯蕷葉形態(tài)差異 Tab.1 Leaf morphological differences of Discorea nipponica Makino

由表1可知，就2個種源地比較而言，除了長寬比之外，關帝山種源地穿龍薯蕷葉片的葉長、葉寬、葉面積、葉裂數(shù)和葉張角的變異系數(shù)均大于蟒河種源地，即關帝山種源地的葉形態(tài)變異大于蟒河種源地。2個種源地都存在2種葉型：長葉型(葉片長度大于寬)和寬葉型(葉片寬度大于長度)：蟒河種源的葉長為4.43～8.30 cm，葉寬為2.26～8.69 cm，長寬比為0.79～2.31；關帝山種源的葉長為3.35～8.59 cm，葉寬為2.13～8.63 cm，長寬比為0.83～1.78。葉片大小差異直接造成葉面積的明顯差異：蟒河種源地葉面積為9.12～52.17 cm2，關帝山種源地5.40～49.29 cm2，變異系數(shù)高達0.34和0.37。此外，葉形態(tài)多樣性在葉裂數(shù)和葉張角方面也有體現(xiàn)：2個種源地的葉裂數(shù)變異系數(shù)分別為0.34和0.36；葉張角差異明顯，關帝山種源地多于蟒河種源地近3°。

進一步統(tǒng)計分析穿龍薯蕷2個種源地不同葉型和各級葉張角所占的比例，結果如圖1所示。

圖1 兩個種源地的葉型和葉張角比例 Fig.1 Percentage of leaf type and leaf angle of two provenances

由圖1可知，就2個種源地的葉型均以長葉型居多，蟒河種源長葉型占83%，關帝山種源長葉型占91%。就葉張角來看，2種源均以第Ⅱ級(40°～50°)比例最大，蟒河種源占38%，關帝山種源占32%；Ⅲ、Ⅳ級次之，即多數(shù)葉片的葉張角為40°～70°。蟒河種源Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級葉張角占總葉數(shù)的83%，關帝山占77%；關帝山種源有>10%的葉片葉張角>70°，蟒河種源有<10%葉片葉張角>70°，但約有12%的葉片葉張角<40°。

統(tǒng)計分析不同葉色的葉型與各級葉張角的比例，結果如圖2所示。

由圖2可知，2種葉色的葉片均以長葉型占據(jù)優(yōu)勢，深色葉中，長葉型占80%，淺色葉中，長葉型占比大于深色葉片，占96%。就葉張角來看，深色葉片中各級葉張角占比接近，Ⅰ～Ⅳ級占89%；淺色葉片中葉張角比例差異較大：第Ⅱ級比例最高，占40%；Ⅱ～Ⅳ級比例占90%，即多數(shù)葉片的葉張角為40°～70°；Ⅰ級占比最少，為3%。

2.1.2 葉形態(tài)指標間的相關性 對穿龍薯蕷葉片的葉色、葉長等形態(tài)指標進行相關性分析，結果如表2所示。

圖2 不同葉色的葉型和葉張角比例 Fig.2 Percentage of leaf type and leaf angle of different leaf color

葉形態(tài)指標Leafmorphologicalindicators葉色Leafcolor葉長Leaflength葉寬Leafwidth葉面積Leafarea葉裂數(shù)Leafcrack葉張角Leafangle葉色Leafcolor1．00葉長Leaflength-0．62??1．00葉寬Leafwidth-0．51??0．81??1．00葉面積Leafarea-0．63??0．86??0．94??1．00葉裂數(shù)Leafcrack-0．110．30??0．51??0．43??1．00葉張角Leafangle0．03-0．22??-0．25??-0．18?-0．40??1．00

注：**.在0.01水平上顯著相關；*.在0.05水平上顯著相關。表3-4同。

Note：**.The significant correlation at the level of 0.01；*.The significant correlation at the level of 0.05. The same as Tab.3-4.

由表2可知，葉長與葉寬、葉面積、葉裂數(shù)呈極顯著正相關，與葉張角呈極顯著負相關；葉寬與葉面積、葉裂數(shù)呈極顯著正相關，與葉張角呈極顯著負相關；葉面積與葉裂數(shù)呈極顯著正相關，與葉張角呈顯著負相關；葉裂數(shù)與葉張角呈極顯著負相關；葉色與葉長、葉寬、葉面積呈極顯著負相關。通過以上分析可知，穿龍薯蕷葉部形態(tài)指標間顯著相關，均可用作穿龍薯蕷種質(zhì)資源篩選。

2.2 葉綠素含量分析

對穿龍薯蕷葉片的葉綠素含量進行測定，并進行各形態(tài)指標不同類型的含量比較，結果列于表3。

由表3可知，穿龍薯蕷葉片葉綠素含量與種源地、葉型相關性不顯著，與葉色相關性極顯著。穿龍薯蕷葉片的葉綠素含量在不同種源地和葉型之間無顯著差異，在不同葉裂數(shù)間存在顯著差異。深綠色葉片的Chla、Chlb和ChlT含量的平均值均高于淺綠色葉片，但Chla/Chlb的平均值小于淺綠色葉片。葉5裂的葉片中，Chla和ChlT含量平均值最高，顯著高于其他3，4裂的葉片；葉6裂的葉片中，Chla/Chlb的平均值最高，為8.62，顯著高于2，3，5裂的葉片。葉綠素含量在不同類型之間葉張角的差異較小。

2.3 葉片光合產(chǎn)物含量分析

對穿龍薯蕷葉片的光合產(chǎn)物含量進行測定，結果如表4所示。

由表4可知，穿龍薯蕷葉片的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和還原糖含量與種源地和葉型的相關性不顯著，與葉色的相關性極顯著。穿龍薯蕷葉片的淀粉含量與種源地相關性極顯著，與葉色相關性顯著，與葉型相關性不顯著。穿龍薯蕷深綠色葉片的4種光合產(chǎn)物含量的平均值都大于淺綠色葉片。2裂葉片的可溶性蛋白質(zhì)和還原糖含量顯著高于其他裂數(shù)葉片，可溶性糖含量顯著高于4裂、5裂和6裂的葉片，淀粉含量顯著高于4裂和5裂的葉片。不同類型葉張角葉片除了淀粉，其他3種光合產(chǎn)物含量均差異顯著，含量的整體變化趨勢是隨葉張角的增大，光合產(chǎn)物含量顯著增加。

進一步分析相關性強弱，結果如圖3所示。

表3 穿龍薯蕷葉綠素含量 Tab.3 Chlorophyll content of Discorea nipponica Makino

注：同一列不同小寫字母示差異顯著(P<0.05)。表4同。

Note：Different letter in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same as Tab.4.

表4 穿龍薯蕷光合產(chǎn)物含量 Tab.4 Photosynthate content of Discorea nipponica Makino

圖3 葉張角與光合產(chǎn)物含量的相關性Fig.3 Correlation between leaf angle and photosynthate content

由圖3可知，穿龍薯蕷葉張角與葉片內(nèi)光合產(chǎn)物的含量顯著相關，但不同產(chǎn)物的相關性強弱不同，依次為可溶性蛋白>可溶性糖>還原糖>淀粉。

3 討論與展望

3.1 薯蕷屬植物葉形態(tài)多樣性情況

薯蕷科中薯蕷屬種類最多，共6組600種，多數(shù)種葉部形態(tài)多樣，以盾葉薯蕷和穿龍薯蕷為甚。其中，盾葉薯蕷葉形為三角狀卵形、心形或箭形，通常3淺裂至3深裂，葉脈掌狀分布[24]；穿龍薯蕷葉片卵圓形，葉色有深綠、淺綠二色，常呈2～6淺裂或深裂。此外，不同分布區(qū)的薯蕷屬植物在葉形態(tài)也存在差異[25]。本研究根據(jù)長寬比可以把薯蕷屬植物的葉片分成兩大類型：長葉型和寬葉型。穿龍薯蕷存在2種葉型，2個種源地葉型都以長葉型為主，關帝山種源的長葉型比例高于蟒河種源。多數(shù)穿龍薯蕷的葉張角為40°～70°。深綠色葉片多為厚紙質(zhì)，淺綠色葉片多為薄紙質(zhì)。葉形態(tài)指標之間的差異反映了穿龍薯蕷葉部形態(tài)特征的多樣性，表明穿龍薯蕷是一個葉形態(tài)“多型性”的種。此外，穿龍薯蕷葉部形態(tài)指標間顯著相關，均可用作穿龍薯蕷種質(zhì)資源篩選。

3.2 葉形態(tài)與有效成分間的關系

植物所處的生態(tài)環(huán)境及豐富的形態(tài)多樣性可能與有效成分之間存在關系，為進一步分析穿龍薯蕷不同種源地、不同類型葉片與其地下根狀莖有效成分薯蕷皂苷元含量之間的關系，本研究先對2個種源地不同形態(tài)葉片的光合產(chǎn)物含量進行了測定。植株體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量的高低間接反映各種代謝活動的強弱，植物產(chǎn)品的品質(zhì)性狀，常以糖含量作為重要指標?？扇苄蕴鞘强偺堑囊粋€重要組成部分，是植物碳水化合物代謝中重要的運輸形式，可溶性糖含量的高低，反映了植株體內(nèi)可利用物質(zhì)和能量的供應基礎[26-27]。淀粉作為營養(yǎng)性多糖，在淀粉酶作用下可以水解為可溶性糖[28]。還原糖是指可被氧化充當還原劑的糖。本研究表明，穿龍薯蕷葉張角與葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、淀粉、還原糖含量顯著相關，含量的整體變化趨勢是隨葉張角的增大，葉片的這4種光合產(chǎn)物含量增大。說明葉張角可用作穿龍薯蕷種質(zhì)資源篩選時首選的葉部形態(tài)指標。

穿龍薯蕷葉部形態(tài)、葉綠素含量和光合產(chǎn)物含量產(chǎn)生差異的原因有兩方面：一是生境的多樣性：葉形態(tài)的差異是對不同生境條件的長期適應造成的；蟒河和關帝山2個分布區(qū)的海拔、林下光照、降水量、日平均氣溫、土壤類型等立地條件不同，使穿龍薯蕷產(chǎn)生了與之相適應的形態(tài)類型。二是遺傳的多樣性：薯蕷屬植物的染色體數(shù)目變異較大，且倍性復雜[29-30]；有研究結果顯示，懷山藥和大薯形態(tài)特征豐富，染色體數(shù)目為40條或60條，葉形態(tài)特征與染色體數(shù)目存在一定的相關性[31-32]。

3.3 穿龍薯蕷研究的展望

穿龍薯蕷葉部形態(tài)存在多樣性，為選種栽培提供了豐富的資源。根據(jù)葉形態(tài)指標進行粗篩，這可以減少篩選的盲目性，提高準確度，縮短野外篩選的時間，大大加快高質(zhì)量種質(zhì)篩選的進程，對于野生穿龍薯蕷資源中高薯蕷皂苷元含量的種質(zhì)篩選、保護和繁殖有著重要意義，對解決甾體藥物原料供應有著現(xiàn)實的經(jīng)濟價值。但基于多樣性研究，尤其是遺傳多樣性的研究方面起步較晚，今后應加強以下幾方面的研究：一是應用常規(guī)研究方法與先進的生物學技術相結合，分析穿龍薯蕷皂苷元含量與多樣性特征之間的關系，研究和評價穿龍薯蕷資源的多樣性；二是應用DNA分子標記的方法比較和分析高皂苷元含量類型的特征性基因片段加強遺傳多樣性的研究；三是加強穿龍薯蕷代謝過程的研究，探索穿龍薯蕷藥用部分(地下莖)生長規(guī)律與薯蕷皂苷元積累的動態(tài)關系，設法對穿龍薯蕷代謝過程進行改造，使之具有最佳薯蕷皂苷元產(chǎn)生模式；四是對薯蕷皂苷元含量高的穿龍薯蕷品種，進行形態(tài)、生理和DNA水平等方面的研究，從中篩選更優(yōu)良的品種，運用組織培養(yǎng)等方法進行擴大利用[17]。

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