郭 敏 ，徐思雨，顧萬(wàn)紅，古秋莉△

1甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省中醫(yī)院

中藥復(fù)方養(yǎng)陰生肌婦炎栓以甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑養(yǎng)陰生肌散(甘藥制字Z04000835)處方為依據(jù)，通過(guò)提取工藝研究，溶媒篩選，基質(zhì)配比研究及制劑工藝考察，研制出便利、高效的用于治療宮頸炎、陰道炎等婦科疾病的養(yǎng)陰生肌婦炎栓劑[1]。

養(yǎng)陰生肌婦炎栓主要由黃柏、龍膽草、雄黃、青黛等藥物組成，龍膽草作為處方中不可缺少的組成部分，具有清熱燥濕，瀉肝膽火的功效，龍膽苦苷性質(zhì)穩(wěn)定，為其中的指標(biāo)成分，故選擇龍膽苦苷在混合提取物中的含量為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法，優(yōu)選中藥復(fù)方養(yǎng)陰生肌婦炎栓的最佳提取工藝[2-4]。

1 材料

1.1 儀器 美國(guó)Waters高效液相色譜儀(包括：Waters 2487紫外檢測(cè)器；Waters 1525自動(dòng)進(jìn)樣器)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；電子分析天平(上海天平儀器廠(chǎng))；超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠(chǎng))。

1.2 試藥 龍膽苦苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)：11070-200510)；甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸水；所用其他試劑均為分析醇。實(shí)驗(yàn)所用藥材由甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 龍膽苦苷的含量測(cè)定[5-8]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：水 - 乙腈(80∶20)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25.0℃；外標(biāo)法。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算不得低于3 500。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取在五氧化二磷減壓干燥器中放置24小時(shí)的龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用甲醇配制成濃度為0.8 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 取約1.0g提取所得浸膏，精密稱(chēng)定，置50 mL燒杯中，加甲醇適量，超聲10分鐘，放冷至室溫，過(guò)濾至25 mL的容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，搖勻。取8 mL移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.1.3 測(cè)定方法 精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，得到色譜峰面積，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法，計(jì)算樣品中龍膽苦苷的含量，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 龍膽苦苷含量測(cè)定HPLC色譜圖

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 因素水平確定 采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]，以提取時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)、溶劑容量(C)為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，應(yīng)用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 提取方法因素水平

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 方差分析 方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表2—3可知，以浸膏得率為考察指標(biāo)，最佳提取條件為A3B3C1；以龍膽苦苷含量為考察指標(biāo)，最佳提取條件為A3B2C2。綜合各提取條件，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的簡(jiǎn)單易行，確定最佳提取工藝為乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為5小時(shí)，溶劑量為8倍量。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 根據(jù)處方配比，取3批組方藥材，按上述所選最佳提取工藝，分別測(cè)定出膏率及龍膽苦苷的含量，結(jié)果表明該工藝達(dá)到了提取條件優(yōu)化的目的，見(jiàn)表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

3 討論

養(yǎng)陰生肌散由我院中醫(yī)專(zhuān)家根據(jù)古方和臨床實(shí)踐配伍而成，在臨床使用20余年，療效確切。由于劑型上的缺陷限制了臨床需要，而其制備工藝簡(jiǎn)單又無(wú)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此不符合相關(guān)法律法規(guī)的要求，需要按國(guó)家新藥申報(bào)的要求對(duì)其進(jìn)行科學(xué)系統(tǒng)地二次開(kāi)發(fā)。

索氏提取時(shí)溶劑的量對(duì)提取效果影響不大，考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本，我們選擇溶劑量以8倍量代替10倍量，而且各味藥的提取效果均無(wú)明顯改變。

[1]李喜香，劉效栓，張小華，等.養(yǎng)陰生肌散急性毒性及全身過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)研究[J].西部中醫(yī)藥，2014，27(1)：29-31.

[2]陳長(zhǎng)勛，劉占文，孫崢嶸，等.龍膽苦苷抗炎藥理作用研究[J].中草藥，2003，34(9)：814-816.

[3]王北嬰，李儀奎.中藥新藥研制開(kāi)發(fā)技術(shù)與方法[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001：788-808.

[4]趙瑞芝，梁偉杰，丘小惠.龍膽藥材中龍膽苦苷的提取工藝研究[J].中國(guó)藥房，2005，16(12)：956-957.

[5]趙冰璐，姜連閣，趙亞芹.薄層掃描法測(cè)定龍膽中龍膽苦苷的含量[J].中醫(yī)藥信息，2000，17(3)：69.

[6]陳二林，黃艷輝，劉效栓，等.養(yǎng)陰生肌散中龍膽苦苷的HPLC測(cè)定[J].西部中醫(yī)藥，2013，26(10)：24-26.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：96.

[8]趙昱瑋，于淼，司學(xué)玲，等.炎熱清片中龍膽苦苷的薄層鑒別及含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(3)：118-120.