劉 帥，曹保利

1天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2天津市南開醫(yī)院婦產(chǎn)科

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的婦科疾病，多發(fā)生于中青年育齡婦女，以痛經(jīng)、不孕、慢性盆腔疼痛或性交痛為主要表現(xiàn)，嚴重影響女性的生活質(zhì)量，近年發(fā)病率有上升趨勢。子宮內(nèi)膜異位癥是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織在子宮腔體以外的部位種植，是一種雌激素依賴性和自身免疫反應性疾病，其表現(xiàn)往往與惡性腫瘤高度相似，具有侵襲、轉(zhuǎn)移、增生、血管生成等特點，而且具有一定的惡變率[1]。相關研究[2]表明，基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)及其趨化因子受體4(CXCR4)構成生物軸廣泛參與體內(nèi)各種生理及病理過程。SDF-1/CXCR4在促進腫瘤細胞的增殖、黏附、定向轉(zhuǎn)移、血管生成及降解細胞外基質(zhì)、誘導免疫耐受中發(fā)揮著重要作用。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜、病灶周圍組織及異位病灶組織中均有SDF-1和CXCR4的表達，且在異位病灶組織及在位內(nèi)膜中的表達明顯高于正常內(nèi)膜組織，說明SDF-1/CXCR4參與了子宮內(nèi)膜異位癥的形成和發(fā)展。

本課題以往相關研究[4]證實復方莪術散可明顯抑制SDF-1、CXCR4的表達且存在劑量依賴關系，說明復方莪術散可明顯降低異位內(nèi)膜組織中SDF-1、CXCR4的表達，對子宮內(nèi)膜異位癥有一定治療作用。而莪術作為復方莪術散中的重要組成藥物，具有行氣破血，消積止痛之功效[5]。莪術提取的有效成分莪術油能顯著減小異位內(nèi)膜病灶的體積，抑制腫瘤血管生成[6]。為進一步認識莪術在復方莪術散中的作用，提高療效，本實驗觀察莪術油對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥SDF-1 mRNA及CXCR4 mRNA表達的影響，為復方莪術散的推廣使用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康未育SD大鼠45只，清潔級，體質(zhì)量200～250 g，購自中國醫(yī)學科學院放射學院研究所實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SCXK(津)2005-0001，自然光照，常規(guī)飼養(yǎng)，適應環(huán)境后開始實驗。

1.2 實驗藥品及試劑 莪術油(南開醫(yī)院研究所提供)，根據(jù)有關研究[2]配制成1%的莪術油注射液，其中各成分的比例為莪術油:吐溫 -80∶水(1∶2∶97)，此狀態(tài)下的莪術油注射液理化性質(zhì)最穩(wěn)定，安全性較高；吐溫-80、無水乙醇(天津市化學試劑供銷公司提供)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，國藥準字J20130009)；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑(購自天津生化科技北京有限公司)。

1.3 實驗儀器 MSC-ADVANTAGE 1.2型生物安全柜(賽默飛世爾科技公司)；CRH-100型恒溫金屬浴(天津市南開醫(yī)院研究所提供)；KUBTOA 3500型冷凍離心機[北京(日本)久保田公司]；IQ5型RT-PCR儀(美國 Bio-Rad公司)；Thermo移液器(艾本德生命科學公司)；去RNA酶移液槍頭(美國Axygen公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型 參照文獻[1]制備非動情期SD大鼠EM模型：予10%的水合氯醛[0.3 mL/100 g(體質(zhì)量)]腹腔注射麻醉大鼠，腹部手術區(qū)剃毛備皮，安爾碘常規(guī)手術消毒，于腹中線尿道口上1 cm處行縱向切開，長越1.5～2 cm，在距離右卵巢約1cm處，結扎右側(cè)子宮遠端局部血管及需切除的子宮段兩端，剪下長約2～3 cm的子宮段，用眼科剪剪開子宮段，剪成5 mm×5 mm大小子宮組織(包括肌層)3塊，以黏膜面朝向腹壁，漿膜面朝向腹腔(1塊移植于腸系膜血管豐富處，另2塊移植于腹壁血管豐富處)，然后進行四角縫合，向腹腔滴入以0.9%生理鹽水溶解的青霉素16萬/kg，而后關閉腹腔。于術后第10天灌注戊酸雌二醇0.2 mg/kg，1次/d，連續(xù) 5天。

1.4.2 分組及給藥 造模3周后，將造模成功的32只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組及莪術油高、中、低劑量組各8只，另設8只健康大鼠作為空白組?？瞻捉M、模型組大鼠每天腹腔注射生理鹽水1次，莪術油[7]低、中、高劑量組大鼠分別每天腹腔注射相應劑量莪術油 20、40、80 mg/(kg·d)。每組均連續(xù)給藥28天。

1.4.3 標本獲取 各組大鼠分別于末次腹腔注射給藥后24小時內(nèi)頸椎脫臼猝死，然后迅速開腹觀察并取出異位內(nèi)膜組織，快速放入液氮中留存，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，留作RT-PCR試驗用。

1.5 檢測指標 先將內(nèi)膜組織中的總RNA提取，然后再將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為C-DNA(以上步驟按說明書嚴格操作，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA提取試劑購自天津生化科技北京有限公司)，在經(jīng)RNase Free處理過的 EP管中建立反應體系：2.5×RealMaster Mix 9 μL，正向引物 0.5μL，反向引物0.5 μL，DNA 模板 2 μL，超純水 8 μL，最終反應體系為20 μL。采用 RT-PCR法檢測各組大鼠內(nèi)膜組織中SDF-1及CXCR4 mRNA的表達；引物設計為上 游 ：5′-ATGCCCCTGCCGATTCTTTG-3′，下 游 ：5′-TTGTTGCTTTTCAGCCTTGC-3′；CXCR4 上游：5′-CCCCATCCTCTACGCCTTCC-3′，5′-GTGTCCACCCCGTTTCCCTT-3′，β-actin上游：5′-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3′，5′-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3′。反應條件為擴增條件：94℃預變性2分鐘，1個循環(huán)；94℃變性 20 秒，35 個循環(huán)；SDF-1，CXCR4，內(nèi)參 β-actin分別為55℃退火30秒，20秒，35個循環(huán)；68℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行分析。計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型組、空白組大鼠子宮內(nèi)膜組織SDF-1mRNA和CXCR4 mRNA的表達 模型組異位與在位子宮內(nèi)膜組織中SDF-1 mRNA的表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組與空白組在位子宮內(nèi)膜組織SDF-1 mRNA的表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組異位內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織及空白組在位子宮內(nèi)膜組織均有CXCR4 mRNA的表達，且各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 SDF-1 mRNA和CXCR4 mRNA在各組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(±s)

表1 SDF-1 mRNA和CXCR4 mRNA在各組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(±s)

注：＊表示與空白組在位子宮內(nèi)膜比較，P＜0.05；#表示與模型組在位子宮內(nèi)膜比較，P＜0.05

組別 只數(shù) m R N A S D F-1 C X C R 4模型組異位子宮內(nèi)膜 8 1.3 3 3±0.1 1 0＊# 1.4 6 4±0.1 8 7＊#模型組在位子宮內(nèi)膜 8 1.1 0 2±0.3 2 7＊ 1.0 5 1±0.2 1 3空白組在位子宮內(nèi)膜 8 0.3 2 6±0.0 5 4 0.3 8 1±0.4 2 5#

2.2 SDF-1 mRNA和CXCR4 mRNA在各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織中的表達 給藥28天后，莪術油高、中、低劑量組SDF-1 mRNA比較差異有統(tǒng)計學意義(F=64.764，P＜0.05)，且各劑量組與模型組異位內(nèi)膜組織SDF-1mRNA的表達比較，均有不同程度的下降(P＜0.05)。莪術油低劑量組與中劑量組CXCR4 mRNA比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；而高劑量組CXCR4 mRNA表達下降明顯，與模型組及莪術油中、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA在各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(±s)

表2 SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA在各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(±s)

注：＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) m R N A S D F-1 C X C R 4模型組異位子宮內(nèi)膜組 8 1.3 3 3±0.1 1 0 1.4 6 4±0.1 8 7莪術油低劑量組 8 1.1 7 6±0.0 5 7＊ 1.1 9 0±0.1 4 6＊莪術油中劑量組 8 1.0 4 6±0.0 6 7＊ 1.0 6 4±0.0 7 5＊莪術油高劑量組 8 0.8 0 6±0.0 7 1＊ 0.8 4 6±0.0 4 2＊

3 討論

SDF-1是CXC趨化因子亞家族的成員之一，又名CXCL12，它由骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生。而SDF-1具有高度親和的特異性受體CXCR4，兩者結合后形成的SDF-1/CXCR4生物學軸廣泛參與體內(nèi)的各種生理及病理過程。研究[7]表明SDF-1/CXCR4生物學軸對腫瘤的影響最為突出，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。目前至少已發(fā)現(xiàn)有23種腫瘤細胞表面表達 CXCR4[8]，其中包括婦科方面的腫瘤如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌，而SDF-1/CXCR4與這些婦科腫瘤發(fā)生的多種機制相關，且有報道[9]證實SDF-1/CXCR4可通過激活多種信號通路而介導腫瘤細胞的運動、趨化、黏附、分泌(如 MMPs、VEGF)、血管生成、生長以及增殖等生物學行為。

子宮內(nèi)膜異位癥是婦科常見病、多發(fā)病，近幾年其發(fā)病率呈上升趨勢。子宮內(nèi)膜異位癥雖然為良性疾病，卻具有黏附-侵襲-血管生成的病理表現(xiàn)的惡性行為。根據(jù)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及異位灶組織中，均有SDF-1及CXCR4表達的研究報道[4]，本實驗建立非動情期大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，結果證實模型組大鼠異位內(nèi)膜組織中SDF-1 mRNA及CXCR4 mRNA的表達明顯高于正常在位內(nèi)膜組織和模型組在位內(nèi)膜組織，說明SDF-1/CXCR4在大鼠子宮內(nèi)膜異位癥形成過程中起到一定作用。

中醫(yī)古代醫(yī)籍中并無子宮內(nèi)膜異位癥病名的記載。但根據(jù)其主要癥狀及體征，中醫(yī)大多將其歸屬于“痛經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等范疇。如《類證治裁·調(diào)經(jīng)論治》記載：“至于經(jīng)期前后腹痛，虛實懸殊。經(jīng)未行而先痛者，血為氣滯，經(jīng)通則痛自除；經(jīng)已行而猶痛者，沖脈本虛，血去則痛益甚?！薄毒霸廊珪D人規(guī)·癌瘕類》更為全面地總結了癥瘕之證乃“疲血留滯作癌，惟婦人有之，其證由經(jīng)期，或由產(chǎn)后，凡內(nèi)傷生冷，或外受風寒，或恚怒傷肝，氣逆而血留，或憂思傷脾，氣虛而血滯；或積勞成積，氣弱而不行，總由血動之時，余血未凈，而一有所逆，則留滯日積，而漸以成癥矣?！碑敶t(yī)家總結古人經(jīng)驗，結合現(xiàn)代臨床研究，一致認為血瘀是子宮內(nèi)膜異位癥的基本病機[10]。在采取傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的過程中，有學者通過研究發(fā)現(xiàn)莪術是使用最為頻繁的中藥之一，排在第3位[11]。莪術味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有行氣破血和消積止痛之功效，常用于治療癥瘕痞塊、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛和食積脹痛等病癥[12]；現(xiàn)代藥理研究[13]表明，莪術具有抗腫瘤、消炎、抗氧化和抗肝毒性等作用。莪術油為莪術的非極性溶劑提取物所含的揮發(fā)油，其成分復雜，主要含有多種低沸點的倍半萜和單萜化合物?，F(xiàn)代藥理研究[14]證實，莪術提取物中有效成分包括莪術油(主要為莪術醇)、β-欖香烯、姜黃素等多種藥理成分，具有抗炎、抗肝纖維化、抑制癌細胞增殖、促進凋亡等多種藥理作用，在腫瘤、消化、精神疾病等方面廣泛應用。這一點已在肝癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌中得到證實。如宋愛莉等[15]研究發(fā)現(xiàn)莪術油能夠有效降低二羥甲基丁酸(DMBA)誘導大鼠乳腺癌前病變組織中VEGF mRNA的表達強度，抑制血管生成，促進乳腺癌細胞凋亡。

本實驗對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥組織中SDF-1、CXCR4表達的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠子宮內(nèi)膜異位癥中在位內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織的SDF-1、CXCR4表達強度均高于正常子宮內(nèi)膜組織的在位內(nèi)膜組織。說明SDF-1、CXCR4可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程，并起到一定作用。此外，隨著給藥劑量的增多，異位內(nèi)膜組織中SDF-1、CXCR4的表達呈同步下調(diào)趨勢，提示莪術油對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用可能與抑制SDF-1、CXCR4的表達有關。

綜上所述，SDF-1、CXCR4與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病存在一定關系，莪術油對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥中SDF-1、CXCR4的表達具有明顯抑制作用，而且濃度越高，抑制作用越強，說明莪術油對子宮內(nèi)膜異位癥的治療有一定作用。此外，莪術作為復方莪術散中的“君藥”，可能在治療子宮內(nèi)膜異位癥中起關鍵作用。

[1]張薇，沈洪沁，黃啟玲，等.非動情期SD大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立[J].中國實驗動物學報，2004，12(1)：21-24.

[2]徐端紅，崔保安，王學兵，等.莪術油注射液的制備及體外抗PRRSV作用試驗[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2010(10)：116-120.

[3]張愛群，孫富國，王昭英.子宮內(nèi)膜異位癥的惡變[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2008，17(5)：385-388.

[4]熊苗，屠菊紅，趙愛民.趨化因子及其受體與子宮內(nèi)膜異位癥的關系[J].中國婦幼健康研究，2006，17(6)：516-518.

[5]張敏，宋殿榮，曹保利，等.復方莪術散對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥基質(zhì)細胞衍生因子-1及其受體表達的影響[J].中國中西醫(yī)結合外科雜志，2016，22(1)：38-41.

[6]孔煜，張家文.他莫昔芬和莪術油聯(lián)合治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的實驗研究[J].四川大學學報：醫(yī)學版，2006，37(4)：596-598.

[7]陳瓊，武明花，李桂源.SDF-1/CXCR4生物學軸與腫瘤關系的研究進展[J].國際病理科學與臨床雜志，2007，27(3)：227-230.

[8]Balkwill F.Cancer and the chemokine network[J].Nature Reviews Cancer，2004，4(7)：540-550.

[9]GassmannP，HaierJ，SchlüterK，etal.CXCR4 regulates the early extravasation of metastatic tumor cells in vivo[J].Neoplasia，2009，11(7)：651-661.

[10]王曼，俞瑾，錢祖淇.子宮內(nèi)膜異位癥、妊娠高血壓綜合征及女性不孕癥的中西醫(yī)結合診療標準[J].中西醫(yī)結合雜志，1991，11(6)：376-379.

[11]吳彥佳.中醫(yī)藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的現(xiàn)代文獻研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2013.

[12]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：194-195．

[13]張煒，劉雯，覃潔萍.中藥莪術的研究概況[J].廣西科學院學報，2006，22(增刊)：481-486.

[14]Gupta SC，Patchva S，Koh W，et al.Discovery of curcumin，a component of golden spice，and its miraculous biological activities[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2012，39(3)：283-299.

[15]宋愛莉，許振國.莪術油對大鼠乳腺癌癌前病變組織中VEGF mRNA 表達的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊，2012，30(4)：679-681.