李 欽 ，范 強(qiáng) ，胡繼宏 ，高 博 ，宋 爽 ，李海東 ，楊麗霞

1甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；3甘肅省渭源縣康榮中藥材科技有限公司；4甘肅省中醫(yī)藥研究院

黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科黃芪屬植物膜莢黃芪及內(nèi)蒙古黃芪的根[1]。黃芪屬植物是一種多年生、深根性的草本藥用植物，別名綿芪、綿黃芪。在我國主要分布于北方地區(qū)，普遍生長在東北的東部山區(qū)及大興安嶺，部分平原地區(qū)亦可見到，此外河北、山西、山東、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆等省區(qū)均有分布。黃芪性溫味甘，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的功效。黃芪的主要化學(xué)成分有多糖類、皂苷類和黃酮類等[2]，具有增強(qiáng)免疫功能、抗應(yīng)激、抗衰老、保肝、利尿、降壓以及較廣泛的抗菌作用[3-8]。但是藥用黃芪由于產(chǎn)地、采收季節(jié)和生長年限的不同而存在差異，這些差異使得不同來源的同種黃芪的化學(xué)組成含量也可能不同，必然影響臨床療效和中藥的實(shí)驗(yàn)研究。富硒黃芪為甘肅省道地藥材，本研究主要觀察富硒黃芪提取物對免疫抑制大鼠模型免疫細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 110只SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研試驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 富硒黃芪、普通黃芪購自甘肅省渭源縣康榮中藥材專業(yè)合作社。提取物的制備：將2種黃芪藥材粉碎過10目篩，加水浸泡30分鐘，經(jīng)超聲提取2次，45 min/次，合并濾液，濃縮，濾過，加適量蒸餾水，將溶液pH調(diào)至近中性，G4垂熔玻璃漏斗濾過，使其成為1g/mL水溶液，滅菌，冷藏備用。使用前用蒸餾水稀釋成1mL/0.1kg(體質(zhì)量)。注射用環(huán)磷酰胺[安道生，Baxter Oncology(德國)提供]。酶聯(lián)免疫試劑盒：白細(xì)胞介素 2(IL-2)、白細(xì)胞介素 4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 LX-820型醫(yī)用低速離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠)；FA2004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 免疫抑制大鼠模型的建立 110只大鼠，腹腔注射環(huán)磷酰胺，每次80 mg/kg(體質(zhì)量)，1次/d，連用3天，構(gòu)建免疫抑制模型大鼠；另取10只大鼠為空白對照組，腹腔注射等體積蒸餾水。第3次注射24小時(shí)后(如造模成功，記作停藥0天)，分別從模型組和空白對照組中各取2只大鼠，采用股動(dòng)脈采血方法取3 mL血液，用于測定血液WBC(如造模成功，本次檢測結(jié)果記做藥物實(shí)驗(yàn)0天)，WBC顯著降低則判定為造模成功，若未顯著降低則繼續(xù)注射環(huán)磷酰胺，直至造模成功。

1.4.2 動(dòng)物分組與給藥 從造模成功后的模型大鼠中選取50只體況接近的免疫抑制模型大鼠，雌雄各半，按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、富硒黃芪提取物高、中、低劑量組(200、100、50 mg/kg)、普通黃芪提取物組(200 mg/kg)，每組10只；另設(shè)10只健康大鼠為空白組。各組大鼠按100mg/(kg·d)劑量灌服相應(yīng)藥物，模型組及空白組大鼠灌服等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)7天。

1.4.3 取材 給藥第7天后，各組大鼠禁食8小時(shí)，頸椎脫位法處死后股動(dòng)脈取血，分離血清，-20℃保存，備檢。

1.4.4 指標(biāo)檢測 1)處死大鼠后取出胸腺、脾臟，記錄質(zhì)量變化，按“胸腺(mg)/體質(zhì)量(g)、脾臟(mg)/體質(zhì)量(g)”計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。2)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ 等免疫細(xì)胞因子含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響(±s) mg/g

表1 黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響(±s) mg/g

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)空白組 1 0 0.7 0±0.1 5 3.0 1±0.4 5模型組 1 0 0.2 3±0.1 1#0.9 6±0.1 4#富硒黃芪提取物高劑量 1 0 0.5 0±0.0 9＊2.4 2±0.4 7＊富硒黃芪提取物中劑量 1 0 0.4 3±0.0 6＊1.9 5±0.5 4＊富硒黃芪提取物低劑量 1 0 0.4 0±0.0 5＊1.6 0±0.2 6＊普通黃芪提取物組 1 0 0.3 6±0.0 9＊1.4 9±0.4 5＊

2.2 富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α表達(dá)水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠IL-2、IL-4、IFN-γ含量降低，TNF-α含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠IL-2、IL-4、IFN-γ含量升高，TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影響(±s) pg/mL

表2 富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影響(±s) pg/mL

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) T N F-α I F N-γ I L-2 I L-4空白組 1 0 3 9.5 2±5.2 8 2 4.3 1±5.8 6 2 6 1.5 1±4 6.2 0 1 8.9 1±2.5 6模型組 1 0 7 0.1 4±6.6 8# 1 0.8 8±3.1 7# 1 5 3.7 4±3 4.9 6# 9.3 2±3.8 6#富硒黃芪提取物高劑量組 1 0 4 1.2 8±7.2 2＊ 2 0.9 0±5.1 8＊ 2 4 8.2 7±4 4.3 2＊ 1 8.1 6±1.7 4＊富硒黃芪提取物中劑量組 1 0 4 3.0 3±5.6 9＊ 1 9.1 0±4.8 1＊ 2 3 7.6 5±2 6.0 8＊ 1 7.6 5±2.2 6＊富硒黃芪提取物低劑量組 1 0 4 4.9 1±1 6.3 9＊ 1 7.6 5±4.2 3＊ 2 3 1.7 2±2 7.1 2＊ 1 6.8 7±1.8 3＊普通黃芪提取物組 1 0 5 2.0 4±7.4 2＊ 1 5.5 0±2.8 3＊ 1 9 0.9 0±1 9.3 6＊ 1 5.5 9±0.9 0＊

3 討論

免疫是人體的一種生理功能，人體依靠這種功能識(shí)別“自己”和“非己”成分，從而破壞和排斥進(jìn)入人體的抗原物質(zhì)，或人體本身所產(chǎn)生的損傷細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，以維持人體健康。因此，免疫相關(guān)研究一直是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)課題，研究較多的是免疫抑制方面，主要針對開發(fā)免疫抑制藥物。在免疫抑制研究方面，動(dòng)物模型的建立直接影響研究的結(jié)果，免疫抑制動(dòng)物模型的建立，一般選用的藥物有環(huán)磷酰胺、長效糖皮質(zhì)激素(氫化可的松、地塞米松)、長春新堿、放線菌素等[9]，其中應(yīng)用最廣泛，研究最多的一種建模藥物是環(huán)磷酰胺。環(huán)磷酰胺是一種細(xì)胞毒性藥物，屬于烷化劑類免疫抑制劑，其能殺死有絲分裂和進(jìn)入循環(huán)周期的細(xì)胞，破壞DNA結(jié)構(gòu)，阻斷復(fù)制，有較強(qiáng)的免疫抑制作用。當(dāng)免疫細(xì)胞受到抗原刺激后，它們在脾臟進(jìn)行增殖分化，而胸腺是T細(xì)胞成熟的重要場所，因此，脾臟和胸腺的相對質(zhì)量和免疫功能有關(guān)[10]。細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是免疫調(diào)節(jié)的潛在靶點(diǎn)。脾臟是最大的外周免疫器官，受抗原刺激后，參與機(jī)體細(xì)胞和體液免疫的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量增生，致脾濾泡增大，脾體積增大；而受到免疫抑制影響時(shí)淋巴組織萎縮，致脾體積縮小。因此，免疫器官指數(shù)說明了免疫器官的發(fā)育狀況，間接體現(xiàn)機(jī)體的免疫狀態(tài)。IL-2、IL-4是T細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的免疫刺激作用，參與免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)，是衡量機(jī)體免疫功能，尤其是細(xì)胞免疫水平的重要標(biāo)志。適量的TNF-α參與機(jī)體的正常免疫調(diào)節(jié)，是機(jī)體免疫防護(hù)的重要介質(zhì)，分泌過多則參與機(jī)體的免疫病理損傷，導(dǎo)致某些疾病[11]。

近年，中醫(yī)藥在免疫方面的研究開展較多。黃芪是我國經(jīng)典傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。味甘性溫，具有健脾補(bǔ)中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌之功效。其主要有效成分為皂苷、多糖、黃酮等。楊小敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能。黃芪多糖對于心腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等多種臨床疾病有積極的療效[13]。黃芪總黃酮具有抗損傷、抗突變、抗腫瘤和抑制動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)效應(yīng)[14]。鑒于藥用黃芪由于產(chǎn)地、采收季節(jié)和生長年限的不同而存在的差異，深入研究富硒黃芪的生物活性，加強(qiáng)深層次的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。劉必旺等[15]將黃芪藥渣發(fā)酵，得到產(chǎn)物富硒酵母，對免疫低下糖尿病模型動(dòng)物進(jìn)行不同藥物干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)富硒酵母可降低纖維蛋白原(FBG)和提高胰島素(INS)水平，同時(shí)可提高WBC，IgG及IL-2等免疫指標(biāo)，黃芪藥渣發(fā)酵產(chǎn)物-富硒酵母具有降糖及提高免疫功能的作用。黃芪本身富含硒，具有降低心肌細(xì)胞對病毒易感性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、刺激免疫球蛋白形成、激活T細(xì)胞、促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用、提高機(jī)體免疫等重要功能[16]。另有研究[17]證實(shí)黃芪對小鼠腦和肝組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有明顯抑制作用，可增強(qiáng)血清、肝組織的硒含量，加強(qiáng)內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的功能，減少由自由基作用生成的脂質(zhì)過氧化物。但目前國內(nèi)外尚缺乏對培育的富硒黃芪的有關(guān)實(shí)驗(yàn)及臨床研究。

本研究選用甘肅省渭源縣康榮中藥材專業(yè)合作社培育的新品種富硒黃芪為研究對象，通過觀察其對免疫抑制模型大鼠的影響，初步探討富硒黃芪對免疫功能的作用，為黃芪新品種的應(yīng)用和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。通過研究發(fā)現(xiàn)：環(huán)磷酰胺可引起大鼠免疫器官質(zhì)量以及免疫細(xì)胞因子TNF-α含量升高，說明大鼠的免疫功能受到抑制。與模型組比較，各藥物干預(yù)組胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示大鼠的免疫功能有所恢復(fù)，表明富硒黃芪提取物能顯著提高環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型大鼠的免疫功能，且這種作用較普通黃芪更為顯著。

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