席曉蓉，程 羽，羊忠山，趙文娟，潘晶晶，袁嘉麗

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種氣流受限、進(jìn)行性發(fā)展的肺系慢性疾病[1-2]。氣道炎癥和氣道重塑是關(guān)鍵病變，也是導(dǎo)致患者肺功能及生活質(zhì)量下降的根本原因[3-4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是COPD氣道重塑過程中重要的致纖維化細(xì)胞因子[5-6]，TGF-β1/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活是氣道重塑發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[7-9]?！皽焯怠焙汀爸痧觥眱蓚€(gè)作用藥對是在前期研究玉屏風(fēng)散加味方全方基礎(chǔ)上進(jìn)行的拆方研究。三七活血化瘀，對氣道重塑血瘀阻滯尤宜；莪術(shù)破血散瘀，既入血分，又入氣分。二者配伍，協(xié)同增效，行血而不傷血，散瘀而不傷正，組成“逐瘀”作用藥對；桑白皮、浙貝母、白芥子組成“滌痰”作用的藥對。本研究采用被動吸煙加氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)的方法復(fù)制COPD大鼠模型，觀察有“滌痰”和“逐瘀”作用的兩個(gè)藥對對COPD大鼠肺組織TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及用藥 雄性SPF級Wistar大鼠90只，體質(zhì)量(200±20)g，由四川省達(dá)碩生物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：0017752。桑白皮15 g，浙貝母15 g，白芥子15 g組成“滌痰”作用藥對；三七9 g，莪術(shù)15 g組成“逐瘀”作用藥對，均購自云南鴻翔一心堂藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。每克生藥加水8 mL煎藥3次后取藥汁，置于4℃冰箱中保存。灌胃前恢復(fù)到常溫后按比例稀釋使用。按成人每日治療劑量再根據(jù)大鼠體表面積換算為等效劑量，此劑量作為實(shí)驗(yàn)藥物的低劑量，在此基礎(chǔ)上經(jīng)濃縮獲得中、高劑量。藥物低、中、高劑量的比例為1∶5∶10。羅紅霉素(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20141201)，調(diào)制成濃度為5.4 mg/mL備用。

1.2 試劑及儀器 脂多糖(LPS，美國Simga公司生產(chǎn))；TGF-β1ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；Smad2/3、Smad7抗體(美國SATA CRUZ公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將90只大鼠隨機(jī)分為正常組9只，其余81只為造模組。造模組于實(shí)驗(yàn)第1、14天腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，固定于大鼠解剖臺上，暴露頸部，用碘消毒并用75%乙醇脫碘，按照大鼠頸部解剖結(jié)構(gòu)，用1 mL注射器以水平方向15°斜刺入氣管，回抽判斷刺入后氣管內(nèi)注入0.2 mL的LPS溶液，實(shí)驗(yàn)第2～56天(注射LPS當(dāng)天除外)上午將大鼠置于自制密閉有機(jī)玻璃箱內(nèi)，注入紅塔山牌香煙煙霧，每次被動吸煙4支，持續(xù)30 min/d，制作COPD模型。正常組大鼠氣管內(nèi)注入等量生理鹽水，不予煙熏。造模28天，正常組與造模組各處死1只大鼠，對比可見造模組支氣管管腔明顯狹窄，支氣管纖毛上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落；支氣管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤；肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，融合成肺大泡。將造模組剩余80只大鼠隨機(jī)分為模型組、羅紅霉素組及“滌痰”作用藥對低、中、高劑量組和“逐瘀”作用藥對低、中、高劑量組，每組10只。實(shí)驗(yàn)第29天開始，“逐瘀”作用藥對高、中、低劑量組與“滌痰”作用藥對高、中、低劑量組及羅紅霉素組每日灌胃給藥1次，按體質(zhì)量每200g灌胃2mL，連續(xù)給藥28天。正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間模型組大鼠死亡2只，“滌痰”作用中劑量組死亡1只。

1.3.2 指標(biāo)檢測 末次灌胃后24小時(shí)取材，無菌操作取肺組織制備肺組織勻漿，于4℃2 000～3 000 r/min離心機(jī)離心20分鐘后收集上清液，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TGF-β1水平。取肺組織進(jìn)行液氮研磨，收集組織粉末，加蛋白抽提緩沖液500 μL，離心取上清。將此樣品加入133 μL 4×SDS 上樣緩沖液，100℃3～5 分鐘，-80℃保存待用。二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量計(jì)算上樣量，將樣品加入預(yù)制的SDS-聚丙酰胺凝膠中電泳分離，采用水浴式電印跡將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(NC膜)上。將膜置于封閉液中過夜，加入一抗，室溫緩慢搖動2小時(shí)洗膜，加入二抗，室溫緩慢搖動1小時(shí)洗膜。而后細(xì)胞色素氧化酶二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、拍照分析，使用凝膠分析軟件測定各條帶的平均光密度值(OD值)，待測蛋白質(zhì)表達(dá)量與β-actin表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnetts′s T 3檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 “滌痰”及“逐瘀”作用藥對對COPD大鼠肺組織TGF-β1的影響 模型組TGF-β1表達(dá)水平高于正常組(P＜0.05)；“滌痰”作用藥對低、中劑量組和“逐瘀”作用藥對低、中劑量組、羅紅霉素組較模型組大鼠TGF-β1表達(dá)水平降低(P＜0.05)，“滌痰”作用藥對和“逐瘀”作用藥對高劑量組TGF-β1表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)水平(±s) ng/L

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)水平(±s) ng/L

注：＊表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) T G F-β 1正常組 8 1 4 1.6 6±1 5.8 4模型組 8 2 1 1.4 3±2 0.9 7＊羅紅霉素組 1 0 1 7 1.0 4±1 5.5 9#“滌痰”作用藥對低劑量組 1 0 1 6 8.5 5±1 9.3 3#“滌痰”作用藥對中劑量組 9 1 7 6.9 6±2 2.8 0#“滌痰”作用藥對高劑量組 1 0 2 0 3.2 1±1 8.5 2“逐瘀”作用藥對低劑量組 1 0 1 6 1.9 5±2 1.9 4#“逐瘀”作用藥對中劑量組 1 0 1 8 0.9 7±2 4.4 5#“逐瘀”作用藥對高劑量組 1 0 2 1 1.0 1±2 4.0 5

2.2 “滌痰”及“逐瘀”作用藥對對COPD大鼠肺組織Smad2/3、Smad7表達(dá)的影響 模型組Smad2/3水平較正常組升高(P＜0.05)；“滌痰”作用藥對低劑量組大鼠肺組織中Smad2/3表達(dá)低于模型組(P＜0.05)。羅紅霉素組、“滌痰”作用藥對高劑量組及“逐瘀”作用藥對低、中、高劑量組大鼠肺組織中Smad2/3表達(dá)高于模型組(P＜0.05)。模型組大鼠肺組織Smad7水平低于正常組(P＜0.05)；“滌痰”作用藥對高劑量組和“逐瘀”藥對低、中、高劑量組Smad7表達(dá)水平高于模型組(P＜0.05)。羅紅霉素組和“滌痰”作用藥對低、中劑量組大鼠肺組織中Smad7表達(dá)低于模型組(P＜0.05)，見圖1、表2。

圖1 各組大鼠肺組織Smad2/3、Smad7蛋白水平的表達(dá)

表2 各組大鼠Smad2/3、Smad7的蛋白表達(dá)水平(±s)

表2 各組大鼠Smad2/3、Smad7的蛋白表達(dá)水平(±s)

注：＊表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別 S m a d 2/3 S m a d 7正常組 1.0 0 0±0.0 0 0 1.0 0 0±0.0 0 0模型組 1.2 2 5±0.2 8 8＊ 0.7 7 3±0.0 0 2＊羅紅霉素組 2.0 1 0±0.0 4 4#0.2 0 0±0.0 1 3#“滌痰”作用藥對低劑量組 0.9 1 0±0.0 1 0#0.8 3 0±0.0 0 7“滌痰”作用藥對中劑量組 1.2 0 4±0.0 0 3 0.8 4 6±0.0 1 9“滌痰”作用藥對高劑量組 1.6 5 4±0.0 3 8 1.1 2 0±0.0 1 1#“逐瘀”作用藥對低劑量組 2.4 0 1±0.0 2 5 1.2 4 3±0.0 1 8#“逐瘀”作用藥對中劑量組 2.3 4 7±0.0 6 6 1.1 7 7±0.0 1 2#“逐瘀”作用藥對高劑量組 2.6 6 6±0.0 8 3 1.0 5 1±0.0 0 9#

3 討論

COPD的發(fā)生、發(fā)展與氣道重塑密切相關(guān)，成纖維細(xì)胞與杯狀細(xì)胞增生、膠原與氨基聚糖沉積、黏液腺增生肥大均與COPD重塑相關(guān)，而TGF-β1參與并調(diào)節(jié)了這些病理過程[10-11]。Smad2、Smad3 是受體調(diào)節(jié)型Smads蛋白，為TGF-β1下游調(diào)節(jié)因子，當(dāng)TGF-β1與其受體TβR-Ⅱ、TβR-I結(jié)合形成復(fù)合物，通過磷酸化Smad2/3將信號從胞漿傳遞入胞核激活轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肺病變。Smad7是抑制型Smads蛋白，在TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路中起負(fù)反饋?zhàn)饔?，Smad7表達(dá)不足，不能抑制Smads信號轉(zhuǎn)錄，從而失去對肺部病變的抑制作用，導(dǎo)致肺功能降低[4]。因此，抑制TGF-β1的產(chǎn)生或(和)活性，拮抗或阻斷TGF-β1/Smads信號途徑可減緩COPD氣道重塑的進(jìn)展[12-13]。

玉屏風(fēng)散加味方基于COPD氣道重塑“肺氣虛衰，痰瘀互結(jié)”的病機(jī)特點(diǎn)，以“益肺散結(jié)”為治則組方而成。黃芪、白術(shù)、防風(fēng)扶正補(bǔ)氣益肺；桑白皮、浙貝母、白芥子平喘滌痰散結(jié)；生三七、莪術(shù)活血逐瘀散結(jié)。本研究將全方進(jìn)行拆方，組成“滌痰”作用和“逐瘀”作用藥對，用被動吸煙加氣管內(nèi)注入LPS的方法復(fù)制COPD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠TGF-β1、Smad2/3 表達(dá)上調(diào)，而 Smad7 表達(dá)下調(diào)?！皽焯怠弊饔盟帉Φ蛣┝恐委熀?，肺組織TGF-β1、Smad2/3表達(dá)下調(diào)；“逐瘀”作用藥對低、中劑量治療后，肺組織TGF-β1表達(dá)下調(diào)，Smad7表達(dá)上調(diào)。提示“滌痰”“逐瘀”作用藥對可能通過干預(yù)TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制TGF-β1信號的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到阻斷COPD氣道重塑的作用。

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