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(1.上海市奉賢區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 奉賢201400；2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海 奉賢201400)

0 引言

雞新城疫(ND)，又稱亞洲雞瘟，是由副粘病毒引起的一種禽類的急性、烈性、高度接觸性傳染病，其病毒按毒力強弱可分為低毒力、中毒力和強毒力3種類型。雞科動物的各種禽類均對該病毒易感，且雛雞比成年雞易感性更高，臨床常呈急性敗血癥癥狀。在非免疫或免疫力低下的雞群中，一旦有強毒侵入，發(fā)病率和死亡率可達(dá)90%以上，對養(yǎng)雞業(yè)危害巨大。

雞傳染性支氣管炎(IB)是由冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種雞的高度接觸性傳染病。其對各種日齡的雞均易感，但5周齡以內(nèi)的雞癥狀明顯，且各品種間無明顯的差異，死亡率15%～19%；如果是腎病變型毒株感染，其發(fā)病率和死亡率可明顯上升。成年雞感染本病的死亡率較低，主要表現(xiàn)產(chǎn)蛋下降、蛋品質(zhì)降低等癥狀，是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。

山雞人工養(yǎng)殖是一項新興的特養(yǎng)產(chǎn)業(yè)，其在國內(nèi)的形成和發(fā)展僅有二十余年歷史，但由于其特有的經(jīng)濟(jì)和觀賞價值，近幾年的市場需求快速增長，商品山雞(活體)的市場售價已達(dá)48～50元/kg，國內(nèi)人工養(yǎng)殖的規(guī)模和數(shù)量正逐年快速上升。野外生存時，山雞具有較強的抗病能力；但快速發(fā)展的規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖，在加速山雞抗病能力退化的同時，也顯著增加了各類疫病的發(fā)生概率，特別是在當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)化水平較低的情況下，山雞人工養(yǎng)殖缺乏科學(xué)的免疫程序和操作技術(shù)規(guī)范。山雞種群的不規(guī)范免疫、免疫水平低下和免疫抗體的不平衡使免疫失敗現(xiàn)象時有發(fā)生，造成山雞養(yǎng)殖場中非典型雞ND、IB等疫病時有發(fā)生，嚴(yán)重制約了山雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為此，筆者針對山雞ND和IB的免疫問題，選擇一家大型山雞養(yǎng)殖公司，組織開展了一輪山雞全周期(1個世代、56周)ND和IB免疫抗體的跟蹤檢測和消漲規(guī)律的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗山雞

某大型山雞養(yǎng)殖場1日齡祖代種山雞雛苗1萬羽，上海欣灝珍禽育種有限公司2016年7月2日出雛；孵化過程嚴(yán)格按照種蛋孵化流程操作。

該批試驗山雞的入孵種蛋為43周齡健康種山雞所產(chǎn)。該批次親本母山雞在整個飼養(yǎng)期已分別于9日齡和12日齡采用新支H120弱毒疫苗噴霧或滴鼻免疫各一次并于35日齡、65日齡和195日齡分3次實施了新支流(或新支減)滅活疫苗的免疫；種山雞開產(chǎn)后，每隔二個月采用新支H52弱毒疫苗飲水免疫一次。

1.1.2 免疫疫苗

1.1.2.1 新支H120二聯(lián)弱毒疫苗

雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)弱毒疫苗(L株+H120株)；生產(chǎn)商：哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；批號：2015004；有效期：2016.11.23。

1.1.2.2 新支流三聯(lián)滅活疫苗

雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗(L株+M41株+YBF003株)；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；批號：150230905；有效期：2017.1.13。

1.1.2.3 新支H52二聯(lián)弱毒疫苗

雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)弱毒疫苗(L株+H52株)；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；生產(chǎn)批號：160710502；有效期：2018.5.29。

1.1.2.4 新支減三聯(lián)滅活疫苗

雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合癥三聯(lián)滅活疫苗(N79株+M41株+NE4株)；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；批號：160960204；有效期：2016.8.31。

1.1.3 檢測試劑

1.1.3.1 雞新城疫檢測試劑

抗原：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；批號：20160504；效價為210。

標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；批號：20150721。

標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；批號：20150902。

1%雞紅細(xì)胞懸液：采集無新城疫抗體的健康公雞血液10 mL，與等體積阿氏液混合后，用pH值為7.2,0.01moL/L的PBS液洗滌3次，每次均以2 500～3 000 rpm/min離心5 min；洗滌后用PBS液配成1%雞紅細(xì)胞懸液，2℃～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3.2 傳染性支氣管炎檢測試劑

IDXXX傳染性支氣管炎病毒抗體檢測試劑盒：北京愛得士元亨生物科技有限公司提供，批號：CN449；內(nèi)含：IBV抗原包被板、陽性對照、陰性對照、空白對照、酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶(HRPO)結(jié)合物、樣品稀釋液、TMB底物、終止液等。

結(jié)果判定：樣品的S/P值<或=0.2判為陰性；樣品的S/P值>0.2判為陽性，表明已接種過疫苗或感染過IBV。在免疫時效期監(jiān)測和記錄有代表性樣品的抗體滴度是雞群免疫狀況的最好評價，得出的雞群狀況可對免疫全過程中抗體滴度的分布和變化進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 試驗山雞飼養(yǎng)

1.2.1.1 育雛期飼養(yǎng)

0～35日齡為育雛期；育雛舍采用智能內(nèi)環(huán)境自動控制系統(tǒng)；雛山雞采用四層疊層式立體育雛籠飼養(yǎng)。

1.2.1.2 保育期飼養(yǎng)

36～55日齡為保育期，采用內(nèi)環(huán)境水供暖自動加熱系統(tǒng)和雙層階梯式保育籠飼養(yǎng)。

1.2.1.3 育成期飼養(yǎng)

分育成前期和育成后期2個階段，其中： 56～120日齡為育成前期，采用暗光照地面平養(yǎng)方式飼養(yǎng)；121日齡～開產(chǎn)(一般在190～195日齡)為育成后期，又稱為產(chǎn)蛋準(zhǔn)備期；采用3層疊層單雞單籠式種山雞籠飼養(yǎng)。

1.2.1.4 種用期

開產(chǎn)～淘汰(一般持續(xù)種用至56周齡全群淘汰)為種用期。采用三層疊層單雞單籠式種山雞籠飼養(yǎng)。

對試驗山雞全周期實施以下新城疫和傳染性支氣管炎免疫：詳見表1。

1.2.3 采樣與樣品處理

1.2.3.1 親本母山雞采樣

對試驗山雞的親本母山雞，在留取種蛋(43周齡)時隨機采取20份血液樣品。

1.2.3.2 育雛期采樣

對剛出殼0日齡雛山雞，隨機抽取20羽采血；以后每隔10天隨機抽取20羽雛山雞采取血樣，共采集0日齡、10日齡、20日齡、30日齡等四個批次、80份血樣；由于雛山雞體型偏小，此期采血可取心臟采血法或直接頸動脈放血采樣。

表1 試驗山雞新城疫和傳染性支氣管炎免疫匯總表

1.2.3.3 育成期及后續(xù)樣品采集

育成期60日齡時隨機采取20份血樣，以后每隔30 d在試驗山雞群中隨機采取20份血樣，共采集60日齡、90日齡、120日齡、150日齡、180日齡、210日齡、240日齡、270日齡、300日齡和330日齡等10個批次、200份血樣。

1.2.3.4 樣品處理與保存

我校已有“控制科學(xué)與工程”一級學(xué)科碩士點，也是廣東省優(yōu)勢重點學(xué)科，“控制理論與控制工程”、“檢測技術(shù)與自動化裝置”兩個專業(yè)是二級學(xué)科。依托學(xué)科建設(shè)，廣東省教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項目——電氣工程綜合訓(xùn)練中心，深入研究提升實驗教學(xué)水平，形成技術(shù)積累，促進(jìn)教學(xué)長足發(fā)展。專業(yè)教師除了完成自身教學(xué)任務(wù)，還應(yīng)該根據(jù)學(xué)科發(fā)展方向和社會需要積極開展科研，將科研項目和成果作為實驗教學(xué)內(nèi)容更新、提高教學(xué)水平和實驗技術(shù)方法提升的源泉。各級各類的研究成果轉(zhuǎn)化為實驗項目，為學(xué)生的課程設(shè)計、大型作業(yè)、畢業(yè)設(shè)計、科創(chuàng)競賽選題提供依據(jù)，學(xué)生在進(jìn)行這些實驗項目時可以激發(fā)他們學(xué)習(xí)興趣、鍛煉他們的實驗技術(shù)方法和創(chuàng)新能力[10]。

整個試驗共采集試驗山雞14個批次、280份血液樣品和43周齡親本母山雞1個批次、20份血液樣品，總數(shù)為15個批次、300份血液樣品；每個批次樣品在采集后立即分離血清，標(biāo)記后冷凍保存；至全部15個批次血樣全部采集完成后集中監(jiān)測。

1.2.4 樣品檢測

1.2.4.1 雞ND抗體檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)

抗體檢測方法：采用血凝抑制(HI)試驗檢測方法，試驗山雞全周期280份血樣和親本母山雞20份血樣同時進(jìn)行雞ND抗體檢測

評定標(biāo)準(zhǔn)：HI滴度效價≧5log2判為抗體合格。

1.2.4.2 傳染性支氣管炎抗體檢測方法與評定標(biāo)準(zhǔn)

抗體檢測方法：采用ELISA試驗方案對300份試驗樣品同時進(jìn)行抗體檢測。

評定標(biāo)準(zhǔn)：陰、陽對照成立確定試驗有效，樣品OD值>臨界值判為陽性，否則判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

2.1.1 親本母山雞1個批次樣品ND免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

43周齡親本母山雞的20份血樣，ND免疫抗體檢測結(jié)果全部合格，且HI均值達(dá)8.6 log2，其中最高值為10 log2、最低值為7 log2；20份樣品HI值分布情況見表2。

表2 20份親本母山雞血樣ND免疫抗體HI值分布情況匯總表

2.1.2 親本母山雞1個批次樣品IB免疫抗體檢測結(jié)果

43周齡親本母山雞20份血樣IB抗體檢測結(jié)果全部合格，且OD均值達(dá)0.497，顯著大于臨界值0.0923；而在20份檢測樣品中，除1份樣品的OD值接近臨界值，其余19份樣品的OD值均大于陽性對照血清的OD值。

2.1.3 試驗山雞14個批次樣品ND抗體檢測結(jié)果

14個批次、280份樣品的ND抗體HI均值和陽性合格率匯總結(jié)果見表3和圖1、圖2。

表3 ND抗體HI均值和陽性合格率匯總表

圖1 14個批次樣品ND抗體HI均值折線圖

圖2 14個批次樣品ND抗體陽性合格率折線圖

2.1.4 14個批次樣品IB抗體檢測結(jié)果

14個批次樣品IB抗體ELISA試驗OD均值見表4。

14個批次樣品IB抗體ELISA試驗OD均值及合格率變動情況見圖3和圖4。

圖3 各批次樣品ELISA試驗OD均值折線圖

表4 各批次樣品ELISA試驗OD均值匯總表

2.2 分析

2.2.1 ND母源抗體分析

從表2、表3可以看到，親本母山雞在留取種蛋時的ND免疫抗體較好，20份樣品全部合格，且HI均值達(dá)到8.6 log2的高水平；而該批種蛋孵化的雛山雞也較好地繼承了母源抗體，0日齡雛山雞的HI均值達(dá)到了7.45 log2，且20份樣品100%合格。

從表3中還可以發(fā)現(xiàn)，雛山雞ND母源抗體的消退速度較快，至20日齡時的HI均值僅為4.2 log2，已低于了5 log2的合格標(biāo)準(zhǔn)，而且陽性合格率也降低至50%，低于70%的群體合格標(biāo)準(zhǔn)。從圖一中可以更直觀地看到母源抗體HI均值有一個平穩(wěn)且較快速消退的陰性曲線；圖二中的陽性合格率曲線也印證了這一現(xiàn)象；提示應(yīng)在10日齡左右對雛山雞進(jìn)行一次ND有效免疫。

2.2.2 ND免疫抗體分析

結(jié)合試驗山雞免疫程序，分析表3可見，試驗山雞在9日齡和12日齡時采用噴霧和滴鼻的方式分別進(jìn)行了新支H120二聯(lián)弱毒疫苗的免疫后，該階段的ND抗體HI均值仍呈現(xiàn)穩(wěn)定下降現(xiàn)象，未見抗體反彈上升的趨勢，說明這二次免疫未對試驗山雞產(chǎn)生免疫作用。

33日齡肌肉注射新支流三聯(lián)滅活疫苗產(chǎn)生了較強的免疫反應(yīng)，試驗雞群ND免疫抗體的HI均值快速上升至9.95 log2的高水平，且樣品陽性合格率達(dá)到100%；69日齡采用新支流三聯(lián)滅活疫苗加強免疫后，HI均值在8.35 log2以上的高位持續(xù)了4個多月的時間，且均衡穩(wěn)定，樣品陽性合格率也持續(xù)保持100%；194日齡加強免疫新支減三聯(lián)滅活疫苗后，210日齡檢測的免疫抗體HI均值在原高位又上升了2.5個滴度，達(dá)到了10.85 log2的高水平，并在240日齡時進(jìn)一步提高至本次試驗的最高峰11 log2，說明3次肌肉注射免疫均起到了較好的免疫作用。

圖4 各批次樣品ELISA試驗陽性合格率分布折線圖

后期在240日齡時對試驗山雞采用新支H52二聯(lián)弱毒疫苗進(jìn)行了一次飲水免疫，但表3的HI均值在此階段呈現(xiàn)穩(wěn)定下降趨勢，說明這次飲水免疫未產(chǎn)生較強的免疫作用。但在330日齡試驗山雞即將淘汰時，在未采取任何免疫措施的情況下，免疫抗體HI均值有一個較強的反彈，圖一的曲線可更直觀地看到這一反彈現(xiàn)象；但記錄顯示此時雞群未見異常，提示此期試驗山雞可能遭到了ND野毒侵襲，由于雞群免疫抗體水平較高而使雞群得到了有效保護(hù)。

2.2.3 IB母源抗體分析

分析試驗結(jié)果可以看到，親本母山雞在留用種蛋時，其IB的免疫抗體達(dá)到了較高的水平，20份樣品的OD均值達(dá)到了0.497，超過0.0923的臨界值達(dá)0.4047。

但從表4可以看到，0日齡雛山雞的母源抗體OD均值僅為0.098，且樣品合格率僅為40%，提示雛山雞未能較好地繼承親本母山雞的母源抗體，而且母源抗體隨著日齡增長而快速消退，至20日齡時，母源抗體已基本消失殆盡，說明試驗山雞在早期未能得到IB母源抗體的保護(hù)，應(yīng)給予有效免疫。

2.2.4 IB免疫抗體分析

試驗過程中，試驗山雞按原免疫程序于9日齡和12日齡時分別采用噴霧和滴鼻的方式進(jìn)行了二次新支H120二聯(lián)弱毒疫苗的免疫，但從表2和圖3、圖4可以看到，二次免疫后的OD均值均未見明顯的提高，說明早期噴霧、滴鼻免疫作用較小、效果較差。

33日齡注射新支流三聯(lián)滅活疫苗后，IB抗體開始回升，但速度較慢，60日齡時的群體合格率僅為25%；69日齡第二次注射新支流三聯(lián)滅活疫苗后，抗體持續(xù)緩慢回升，90日齡和120日齡的OD均值分別為0.228和0.243，但在150日齡時的OD均值有一個突然快速上楊的過程，且1.035的OD均值成為了本次試驗的最高值，比前次測定0.243的OD均值上漲了4倍多，而此階段未進(jìn)行過任何免疫，故疑似試驗雞群受到IB野毒侵襲，但記錄顯示雞群無異常表現(xiàn)，說明雞群的免疫抗體有效抵御了本次野毒的侵襲。以后幾個批次樣品的OD均值緩慢下降，但仍維持在0.335以上的較高水平，而同期樣品的群體陽性合格率也持續(xù)維持在95%以上較高水平，說明IB滅活疫苗的注射可起到較好的免疫作用。

240日齡采用新支H52二聯(lián)弱毒疫苗飲水免疫后，270日齡的OD均值上升了0.156，達(dá)到了0.491的高值，這一結(jié)果與親本母山雞的抗體水平基本相符，說明后期采用中等毒力疫苗飲水免疫可有效提升群體免疫抗體水平。

3 討論

(1)試驗結(jié)果證明：在親本母山雞獲得較好免疫的基礎(chǔ)上，ND母源抗體可較好地遺傳給子代，且維持時間較長；而IB母源抗體的遺傳性較差，且母源抗體的消退速度也較快。

(2)注射免疫新支流(或新支減)三聯(lián)疫苗的免疫作用較明顯，特別是ND抗體，可快速將HI均值提高至最高峰，而IB抗體雖然上升較慢，但二次免疫后即可達(dá)到較高水平，而且抗體消退也較慢。

(3)育雛期采用噴霧、滴鼻等方式免疫新支H120二聯(lián)疫苗的效果較差，未能起到應(yīng)有的免疫作用。后期采用新支H52二聯(lián)弱毒疫苗飲水免疫，對提高IB的抗體有較好的推動作用。

(4)由于存在著IBV在雞體內(nèi)對NDV有干擾的問題，所以在理論上和實踐中，對ND和IB聯(lián)苗的使用價值一直存有爭議；但由于這一聯(lián)苗具有使用方便和節(jié)省資金等優(yōu)點，故應(yīng)用者較多。本次試驗的相關(guān)結(jié)果也是對這一爭議的佐證和應(yīng)用方法的完善。

(5)建議免疫程序：見表5。

表5 ND、IB建議免疫程序