高 陽，陳 明，楊瀅瀅，闞超楠，陳楚英，劉善軍，陳金印,2*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西 南昌 330045；2.萍鄉(xiāng)學(xué)院，江西 萍鄉(xiāng) 337055)

柑橘是世界上最重要的商品水果，是我國南方栽培面積最廣的果樹，它包括的種類很多，主要栽培的有甜橙、寬皮柑橘、柚、金橘和檸檬等，而每一種類又有許多優(yōu)良品種。靖安椪柑(CitrusreticulataBlanco cv. Ponkan)是頗具特色的江西地方品種，有“遠(yuǎn)東橘王”之稱，具有果形美、色澤艷、肉脆和耐貯藏等優(yōu)點，但存在果實偏酸等問題[1-2]。

柑橘果實有機(jī)酸以檸檬酸為主，檸檬酸代謝是生物體內(nèi)重要的代謝途徑，它是果實品質(zhì)研究的一個熱點[3]。近年來，大多數(shù)研究表明，柑橘果實檸檬酸積累水平與合成無直接相關(guān)，而受降解速率的調(diào)控，肖玉明等[4]研究表明干旱脅迫下溫州蜜柑果實檸檬酸大量積累，造成其主要原因是檸檬酸降解酶基因CitIDH與CitNADPIDH表達(dá)量下調(diào)。GABA途徑是果實檸檬酸降解重要環(huán)節(jié)[5]，Cercós等[6]利用柑橘EST 數(shù)據(jù)，通過基因芯片對柑橘果實發(fā)育和成熟階段的7 000個基因的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，提出了柑橘果實成熟期間檸檬酸代謝和利用的一條新途徑(GABA途徑)：檸檬酸先降解成異檸檬酸，再生成2-酮戊二酸和谷氨酸；谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD)的催化生成γ-氨基丁酸(GABA)，GABA在相關(guān)酶的作用下生后生成半醛琥珀酸和琥珀酸[7]，該條途徑在檸檬酸的降解過程中起著重要作用。

熱處理可以有效地促進(jìn)果實有機(jī)酸含量的下降，Wang[8]研究表明‘Northeaster’草莓45 ℃熱處理40 min或 42 ℃熱處理60～100 min后可滴定酸含量明顯降低，且檸檬酸和蘋果酸含量均減少。紅富士蘋果[9]和新余蜜橘[10]經(jīng)熱空氣處理后在可滴定酸含量顯著降低。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，熱處理能顯著降低椪柑貯藏期間有機(jī)酸的含量，增加可溶性糖的積累[11]。

為更好地探索柑橘果實檸檬酸的降解機(jī)制，本文以含酸量較高的靖安椪柑幼果(盛花后120 d)[12]為試驗材料，研究了熱空氣處理對靖安椪柑果實檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為提高椪柑果實品質(zhì)方法的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

靖安椪柑果實于2014年9月10日(盛花后120 d)采自江西省靖安縣果業(yè)局果園。果實成熟度和大小一致，采摘后立即運(yùn)回江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室。

將采摘的果實分為2組：對照組果實不作處理，處理組果實在培養(yǎng)箱[(40±0.5)℃、90%～95% RH]中熱空氣處理48 h，處理果和對照果采用單果塑料薄膜包裝，于溫度保鮮柜[(10±1)℃、85%～90% RH]中進(jìn)行低溫貯藏。每10 d取一次樣測定相關(guān)指標(biāo)，每個處理每次取樣10個果，3次重復(fù)。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 可滴定酸(TA)含量測定 采用酸堿中和滴定法測定，結(jié)果以檸檬酸的量換算。

1.2.2 有機(jī)酸含量的提取與測定 果實有機(jī)酸含量的提取參照Chen等[13]的方法，采用高效液相色譜法(HPLC)測定其含量。有機(jī)酸測定的色譜條件為：C18柱(4.6 mm×250 mm)，柱溫為25 ℃；流動相為50 mmol/L磷酸氫二氨(pH=2.7)，流速為0.5 mL/min；二極管陣列檢測器檢測。

1.2.3 RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄 RNA的提取采用CTAB法進(jìn)行。提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測。RNA逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，制備cDNA用于熒光定量分析。

1.2.4 熒光定量PCR 使用Bio-RAD熒光定量PCR儀(CFX96TMReal-Time System)，美國TaKaRa公司的SYBR Preminx Ex TaqTM進(jìn)行Q-PCR基因定量表達(dá)分析。內(nèi)參基因與檸檬酸相關(guān)基因引物設(shè)計參照陳明[13]的設(shè)計，引物序列由華大科技公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR(TaKaRa，日本)12.5 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)程序為：95.0 ℃的預(yù)變性30 s，40個循環(huán)的95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；溶解曲線：60 ℃保溫30 s，95 ℃保溫30 s。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗采用完全隨機(jī)設(shè)計，使用Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和GraphPad Prism 5 Demo作圖，用DPS7.0軟件中Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱空氣處理對靖安椪柑果實有機(jī)酸和可滴定酸含量變化的影響

靖安椪柑果實有機(jī)酸以檸檬酸為主，隨貯藏時間延長，檸檬酸含量呈不斷下降趨勢(圖1A)，但熱空氣處理顯著促進(jìn)了檸檬酸的降解，熱處理48 h后果實檸檬酸含量為33.44 mg/g，顯著低于對照果實的35.14 mg/g，熱空氣處理和對照果實檸檬酸含量在貯藏第60天時分別為28.98 mg/g和32.38 mg/g?？鼘幩岷途剖岷吭谫A藏期間均呈先升后降的趨勢(圖1B、C)，熱空氣處理果實的酒石酸含量在貯藏第2天時為0.90 mg/g，而對照為0.64 mg/g，兩者差異顯著；熱空氣處理果實的奎寧酸含量在貯藏第2天時達(dá)到最大值7.98 mg/g，而對照在貯藏第10天時才達(dá)到最大值8.22 mg/g。靖安椪柑果實蘋果酸含量很低(圖1D)，在整個貯藏期間均低于0.053 mg/g，且兩個處理間差異不顯著。靖安椪柑果實總有機(jī)酸和可滴定酸含量變化整體和檸檬酸類似(圖1E、F)，均呈整體下降的趨勢，從貯藏第2天到第60天熱空氣處理果實的總有機(jī)酸和可滴定酸含量均低于對照。綜合分析可知，熱空氣處理能顯著促進(jìn)靖安椪柑果實有機(jī)酸含量的下降，且以降低檸檬酸為主。

圖1 熱空氣處理對靖安椪柑果實有機(jī)酸和可滴定酸含量的影響Fig.1 Effects of hot air treatment on the content of organic acids and TA in Jingan ponkan fruits

2.2 熱空氣處理對靖安椪柑果實檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 熱空氣處理對果實CitCSs表達(dá)量的影響 柑橘果實檸檬酸的合成與檸檬酸合成酶(CS)密切相關(guān)，在柑橘基因組中有2個CS基因家族成員，分別為CitCS1和CitCS2。從圖2可以看出，靖安椪柑果實的CitCS1表達(dá)經(jīng)過熱空氣處理48 h后顯著高于對照，且在整個貯藏期間保持較高水平。CitCS2表達(dá)在貯藏期間呈先升后降的趨勢，熱空氣處理誘導(dǎo)CitCS2表達(dá)在貯藏前期略高于對照，但從貯藏第40天開始熱處理果實一直低于對照。

圖2 熱處理對靖安椪柑果實CitCSs表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of hot air treatment on expressions of CitCSs in Jingan ponkan fruits

2.2.2 熱空氣處理對果實CitAcos表達(dá)量的影響 順烏頭酸酶(Aco)將檸檬酸催化分解為異檸檬酸。柑橘Aco基因包括CitAco1、CitAco2和CitAco3 3個家族成員。由圖3可知，靖安椪柑果實CitAco1表達(dá)量隨檸檬酸含量的下降呈上升的趨勢，熱空氣處理后從第10天開始果實CitAco1表達(dá)量顯著高于對照，在貯藏第60天時，熱空氣處理果實CitAco1表達(dá)量是對照的2.07倍。CitAco2表達(dá)是呈先上升后下降的趨勢，熱空氣處理果實在貯藏第20天時到達(dá)最大，對照在第10天表達(dá)量達(dá)到最大，但熱空氣處理后的整個貯藏期間CitAco2表達(dá)量均高于對照。靖安椪柑果實CitAco3表達(dá)并不穩(wěn)定，熱空氣處理僅誘導(dǎo)貯藏前期CitAco3表達(dá)，尤其是處理2 d后急劇增加，為對照的3.18倍。

圖3 熱空氣處理對靖安椪柑果實CitAcos表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of hot air treatment on expressions of CitAcos in Jingan ponkan fruits

2.2.3 熱空氣處理對果實CitIDHs表達(dá)量的影響 異檸檬酸脫氫酶(IDH)參與檸檬酸的降解，它將異檸檬酸降解為2-酮戊二酸。由圖4可知，靖安椪柑果實CitIDH1表達(dá)量隨貯藏時間的增加總體呈遞增的趨勢，熱空氣處理果實CitIDH1表達(dá)量在貯藏第10天顯著高于對照。熱空氣處理48 h后果實CitIDH2表達(dá)量急劇上升，達(dá)到了對照的2.98倍，之后其表達(dá)量迅速回落，這說明熱空氣處理能短暫誘導(dǎo)CitIDH2的表達(dá)。靖安椪柑果實CitIDH3表達(dá)在貯藏期間整體呈上升的趨勢，在貯藏第10天時，熱空氣處理果實CitIDH3表達(dá)量顯著高于對照，且之后一直高于對照。

2.2.4 熱空氣處理對果實CitGADs和CitGSs表達(dá)量的影響 谷氨酸一方面可以在谷氨酸脫氫酶(GAD)的作用下進(jìn)入GABA循環(huán)，另一方面它還可以在谷氨酰胺合成酶(GS)作用下催化生成谷氨酰胺進(jìn)入氨基酸代謝。從圖5可以看出，CitGAD4表達(dá)量在整個貯藏期間呈先升后降的趨勢，對照果實在貯藏第30天達(dá)到最大值，熱空氣處理果實CitGAD4表達(dá)量在貯藏第2天急劇上升，達(dá)到了對照的1.98倍，且一直保持較高水平。而靖安椪柑果實CitGAD5表達(dá)量在整個貯藏期間都較低水平，在貯藏第2、10和30天時熱空氣處理果實CitGAD5表達(dá)量顯著高于對照。靖安椪柑果實CitGS2表達(dá)量在各貯藏期間比較穩(wěn)定，熱空氣處理和對照之間無顯著性差異。

圖4 熱空氣處理對靖安椪柑果實CitIDHs基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of hot air treatment on expressions of CitIDHs in Jingan ponkan fruits

圖5 熱空氣處理對靖安椪柑果實CitGADs和CitGS表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of hot air treatment on expressions of CitGADs and CitGS in Jingan ponkan fruits

3 討論與結(jié)論

采后熱空氣處理對果實品質(zhì)有顯著影響，其結(jié)果因品種不同而存在差異。杜正順等[14]用40 ℃熱空氣處理“豐香”草莓30 min可以明顯抑制貯藏期間果實花青素的積累，延緩果實可溶性固形物、可滴定酸含量和硬度下降，保持果實的貯藏品質(zhì)。Lara等[15]研究表明，熱處理能讓Dixiland桃檸檬酸和蘋果酸含量分別降低50%和20%。關(guān)于柑橘果實熱處理的研究已有報道，李紹佳[16]和陳明[17]研究表明40 ℃熱空氣處理48 h能有效降低椪柑果實有機(jī)酸含量，提高果實品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，熱空氣處理能顯著加速靖安椪柑幼果檸檬酸含量的下降，從而降低有機(jī)酸含量，在貯藏后60 d熱處理果實檸檬酸含量比對照低1.70 mg/g，這與課題組之前的研究結(jié)果[11]一致。

CS廣泛存在于果實細(xì)胞中，是檸檬酸合成的關(guān)鍵酶[18]。張規(guī)富[19]發(fā)現(xiàn)不同時期的水分脅迫均能促進(jìn)發(fā)育階段柑橘果實CitCS1和CitCS2的表達(dá)上調(diào)，這可能是導(dǎo)致果實有機(jī)酸積累原因之一。本試驗結(jié)果顯示，熱空氣處理誘導(dǎo)靖安椪柑果實CitCS1和CitCS2表達(dá)，但同時促進(jìn)果實檸檬酸含量降低，說明熱空氣處理可能通過加速檸檬酸的降解來促進(jìn)靖安椪柑果實有機(jī)酸含量的下降，這與前人[11]的研究結(jié)果一致。

大量研究表明，檸檬酸的降解與Aco密切相關(guān)，Jiang 等[20]發(fā)現(xiàn)地表覆膜后椪柑果實Aco活性顯著降低，檸檬酸含量顯著增加。在番茄中當(dāng)SlAco3a和SlAco3b受抑制時，Aco活性及其轉(zhuǎn)錄水平均下降，成熟果實檸檬酸含量增加。本試驗結(jié)果表明(40±0.5)℃熱空氣處理后，靖安椪柑果實基因CitAco1、CitAco2表達(dá)量在整個貯藏期均上調(diào)，CitAco3表達(dá)量在熱空氣處理2 d后急劇增加，推測熱空氣處理誘導(dǎo)CitAco1、CitAco2表達(dá)可能是幼果期靖安椪柑果實有機(jī)酸含量下降的原因之一。IDH在果實有NADP-IDH和NAD-IDH兩種存在形式，催化異檸檬酸降解為2-酮戊二酸[21]。熱空氣處理誘導(dǎo)靖安椪柑果實CitIDH1和CitIDH3表達(dá)，短暫誘導(dǎo)CitIDH2的表達(dá)，導(dǎo)致檸檬酸進(jìn)一步降解。

GABA途徑是近來年認(rèn)為是檸檬酸降解的一個重要途徑，Aprile等[22]研究發(fā)現(xiàn)GABA途徑中GAD和氨基酸合成相關(guān)酶基因在甜檸檬中呈高表達(dá)，認(rèn)為其參與了檸檬酸降解。LIU 等[23]研究發(fā)現(xiàn)注射脫落酸和硫酸鉀葉面噴施能顯著增加溫州蜜柑TA含量，并顯著降低GAD活性以及CsGAD1轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步表明CsGAD1在柑橘果實的檸檬酸降解利用中的重要作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，熱空氣處理后，靖安椪柑果實CitGAD4表達(dá)量在貯藏第2天急劇上升，且一直保持較高水平，而在整個貯藏期間CitGAD5表達(dá)量都較低，且CitGS2基因的表達(dá)量在整個貯藏期間比較穩(wěn)定，熱空氣處理和對照之間無顯著性差異。由此推測熱空氣處理誘導(dǎo)CitGAD4表達(dá)激活GABA途徑從而促進(jìn)檸檬酸降解。

綜合以上結(jié)果可以得出，熱空氣處理能促進(jìn)靖安椪柑幼果檸檬酸的降解，使得果實有機(jī)酸含量下降，這種變化和檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān)，其中CitAcos、CitIDH1/3和CitGAD4表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致果實有機(jī)酸下降的主要原因。

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