何雄文，牛美蘭

(1.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004； 2.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063)

糖尿病足潰瘍是指未出現(xiàn)周圍神經(jīng)病變和周圍血管病變的初期糖尿病患者足部感染如甲溝炎、腳氣感染等所造成的足部感染、化膿、潰爛等。目前，干細胞移植治療下肢缺血已得到認可。移植后的干細胞在體內(nèi)分化為平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞，促進血管生成因子分泌。將干細胞移植到缺血下肢，其分化形成新生毛細血管，可增加下肢血流量，達到治療下肢缺血的目的[1-2]。 活血生肌湯是針對糖尿病氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)病證研制的復(fù)方制劑，具有活血通絡(luò)、解痙止痛的功效。方劑中的紅花、丹參、乳香、赤芍、川芎、黨參、生黃芪等可活血祛瘀、調(diào)氣止痛、消腫生肌，對糖尿病微血管病有治療作用。本研究觀察了活血生肌湯聯(lián)合外周血干細胞移植對大鼠糖尿病足潰瘍模型新生血管形成及創(chuàng)面愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

取健康清潔級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量110～140 g大鼠，購自山東省魯抗醫(yī)藥集團有限公司，許可證編號(SCXK魯2015004)，存放在黃河科技學(xué)院動物房，光照12 h/d，溫度20～23 ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥品、試劑與儀器

活血生肌湯處方組成：紅花6 g，丹參 12 g，生黃芪 6 g，乳香 23 g，黨參 14 g，川芎6 g，赤芍14 g，大黃7 g，黃柏2 g，生地黃7 g。藥液由河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥制劑室提供，含生藥量1.25 g/mL。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號20140110；鏈脲佐菌素(STZ)，Amresco公司產(chǎn)品，批號1262C443； 兔抗大鼠CD34、CD44、CD38多克隆抗體,北京義翹神州科技有限公司產(chǎn)品，型號80262-R02H、53953-M08H、65003-T08H； DAPI 4’,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽，武漢博士德公司產(chǎn)品，批號40727ES10；Anti-CD34 /FITC熒光素標記，上海浩然生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號bsF-0646R；重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號S20013036；大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子C(VEGF-C)ELISA檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號ml002952；Trizol總 RNA提取試劑，上海翊圣生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號10606ES60；兔抗大鼠CD34-抗Abnova免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號PAB 18289；DAB試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，貨號DA1010；高脂飼料、檸檬酸鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液，由黃河科技學(xué)院實驗中心供應(yīng)；羥乙基淀粉550，上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司產(chǎn)品，貨號HES-TBD550。RPM1640 Medium ①Nissui日水培養(yǎng)基、德國Sigma 3K15高速(冷凍)離心機，購自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司； EPICS XL II型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立

將健康清潔級雄性SD大鼠80只以高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12 h，按45 μg/g體質(zhì)量腹腔注射STZ，3 d后測空腹血糖?？崭寡恰?7.9 mmol/L為糖尿病模型成功。第2天用液氮棉簽冷凍大鼠右后肢距離髂棘外側(cè)0.5 cm處約20 s，共冷凍3次。一次冷凍后待皮膚復(fù)溫后再行下次冷凍。冷凍后第2天局部充血水腫范圍擴大；第3天水腫范圍局限化，皮膚顏色變暗紅色，第5天形成潰瘍。選取Wagner[3]分級3級的動物入實驗組。

1.4 動物分組與給藥

1.4.1 外周血干細胞的制備

40只實驗大鼠，皮下注射G-CSF 500 ng/g，1次/d，連續(xù)5 d，給藥期間皮下注射肝素抗凝4 100 u/kg，1次/d。以質(zhì)量分數(shù)200 g/L的 烏拉坦0.3 μL/g體質(zhì)量腹腔麻醉，腹主動脈采血，采用密度梯度法離心外周血單核細胞：將細胞懸液在300 g離心力下離心10 min，吸取上層單核細胞層，加入2倍緩沖液；200 g離心力下離心15 min，完全吸去上清；用80 μL的緩沖液/107個細胞重新懸浮細胞，加入CD38、CD34、CD44微珠每20 μL/7.8×107個細胞，混勻；在4～8 ℃孵育15 min；加入1～2 mL/107個細胞緩沖液洗滌細胞，在300 g離心力下離心10 min；完全棄掉上清，加入0.5 mL緩沖液懸浮細胞進入磁性篩選。分選細胞前用0.5 mL緩沖液沖洗柱子，將細胞懸液加到柱子中，用適量緩沖液3次沖洗柱子，每次都要抽空柱池，將分選柱與分選磁鐵分離，放在收集管中；向柱子中加入0.5 mL緩沖液，分選柱塞快速推下，收集得到干細胞。加入無菌的DAPI溶液0.1 mL染色，避光，室溫下靜止15 min，加入2倍緩沖液，在200 g離心力下離心15 min ，丟棄上清部分。RPM1640培養(yǎng)基上稀釋4 mL [干細胞濃度(0.5～2.0)×106/mL]，在冰上保存并計數(shù)細胞數(shù)。在紫外波長下發(fā)藍色熒光為標記細胞的細胞核，收集干細胞，以備移植。

1.4.2 分組與給藥

將造模成功的60只大鼠隨機分為模型對照組、外周血干細胞組、活血生肌湯+外周血干細胞組，每組20只?；钛?外周血干細胞組以活血生肌湯 0.8 g/kg灌胃，給藥體積為10 μL/(g·d)，2次/d。外周血干細胞組、活血生肌湯+外周血干細胞組在距離足潰瘍1 mm邊緣等距4個位點處，一次性皮下內(nèi)膜層注射0.1 mL細胞懸液于小腿肌肉內(nèi)，進針深度1 cm，兩注射位點間距0.5 mm，每個位點注射0.1 mL細胞懸液。 模型對照組、外周血干細胞組灌服等體積的質(zhì)量分數(shù)為5 g/L 的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液。各組連續(xù)灌胃30 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 VEGF水平

實驗結(jié)束，禁食12 h后腹主動脈取血，4 ℃靜置1 h， 3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清分別裝于EP管，置于20 ℃冷凍保存。采用ELISA法檢測血清VEGF水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。設(shè)立標準品的檢測濃度，以酶標儀自動擬合標準曲線，檢測待測孔的OD值。

1.5.2 局部潰瘍VEGF mRNA表達

采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法，操作嚴格按照說明書進行。

1.5.3 免疫組織化學(xué)檢測CD34的表達

采用SP免疫組織化學(xué)染色方法 ，操作嚴格按照說明書進行。

1.5.4 潰瘍局部組織CD34、CD44、CD38蛋白表達

采用免疫蛋白印記法檢測方法，操作嚴格按照說明書進行。

1.5.5 潰瘍面愈合

采用免疫組化檢查潰瘍面愈合情況

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

外周血干細胞組、活血生肌湯+外周血干細胞組大鼠因灌胃操作不當(dāng)各死亡1只。

2.1 各組大鼠血清VEGF、潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達對比

與模型對照組對比，外周血干細胞組血清VEGF水平、潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達不明顯(P>0.05)；活血生肌湯+外周血干細胞組的血清VEGF水平、潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達均增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與外周血干細胞組對比，活血生肌湯+外周血干細胞組血清VEGF水平增加(P<0.05)、潰瘍局部組織VEGFmRNA表達顯著增加(P<0.01)。見表1。

組別n血清VEGF潰瘍局部組織中VEGFmRNA模型對照組2027．42±3．540．27±0．04外周血干細胞組1932．43±1．0?0．38±0．09?活血生肌湯+外周血干細胞組1954．06±7．61???##0．68±0．12???###

注：與模型對照組對比，*P>0.05，***P<0.01；與外周血干細胞組對比，##P<0.05，###P<0.01

2.2 各組大鼠潰瘍局部組織CD34、CD44、CD38蛋白表達對比

與模型對照組對比，外周血干細胞組的CD44表達變化不明顯，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，CD34、CD38表達升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；活血生肌湯+外周血干細胞組局部潰瘍組織CD34、CD44、CD38表達升高(P<0.01)。與外周血干細胞組對比，活血生肌湯+外周血干細胞移植組CD34、CD44、CD38表達升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別nCD34CD44CD38模型對照組200．38±0．200．24±0．020．31±0．01外周血干細胞組190．83±0．01??0．29±0．01?0．46±0．01??活血生肌湯+外周血干細胞組191．00±0．08???##0．66±0．04???##0．79±0．08???##

注：與模型對照組對比，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；與外周血干細胞組對比， ##P<0.05

2.3 各組大鼠潰瘍面愈合對比

各組潰瘍面長徑、短徑均較治療前縮小。與模型對照組對比，外周血干細胞組、活血生肌湯+外周血干細胞組潰瘍面的長徑、短徑均縮小，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與外周血干細胞組對比，活血生肌湯+外周血干細胞組潰瘍面的長徑、短徑均縮小，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

組別n治療前長徑短徑治療30d長徑短徑模型對照組203．72±0．712．63±0．711．14±0．410．82±0．41外周血干細胞組193．41±0．822．43±0．420．84±0．23???0．61±0．16??活血生肌湯+外周血干細胞組193．68±0．922．73±0．620．14±0．12???###0．11±0．10???###

注：治療30 d后，與模型對照組對比，**P<0.05，***P<0.01；與外周血干細胞組對比， ###P<0.01

3 討 論

目前認為糖尿病足發(fā)生的3個要素是血管閉塞性缺血、感染和神經(jīng)病變[4]。本實驗采用高脂飼料+低劑量 STZ復(fù)制糖尿病模型，然后采用液氮棉簽冷凍法復(fù)制大鼠糖尿病足潰瘍模型是基于：長期高脂可以誘發(fā)脂肪、糖代謝紊亂，形成動脈粥樣硬化；低劑量STZ損傷胰島B細胞，加速糖尿病形成；低溫液氮棉簽冷凍引起下肢局部血流減少，損傷局部組織，導(dǎo)致潰瘍形成，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，可在糖尿病的基礎(chǔ)上形成均一的足潰瘍[5-6]。干細胞移植治療糖尿病足潰瘍的基礎(chǔ)理論是因干細胞具有分化能力，可分化成血管內(nèi)皮祖細胞和成血管細胞，這些細胞可以促進新生毛細血管形成，從而改善血液供應(yīng)。移植后的造血干細胞不僅是血液中各種血細胞的原祖細胞，也是血液循環(huán)過程中內(nèi)皮細胞的來源。研究證明干細胞促進血管生成的機制包括：①分化成血管平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞；②直接形成新的血管；③通過旁分泌形成Ang-I、Ang-II、VEGF等多種血管生成因子，促進血管新生[7-9]。

本研究結(jié)果顯示：治療30 d后，活血生肌湯+外周血干細胞組大鼠血清VEGF和潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達較模型對照組增加(P<0.01)。與模型對照組比，干細胞組CD44蛋白表達不明顯(P>0.05)，而CD38、CD34蛋白表達增加(P<0.05)；活血生肌湯+外周血干細胞組CD38、CD34、CD44蛋白量表達顯著增加(P<0.01)。外周血干細胞組、活血生肌湯+外周血干細胞組大鼠潰瘍面較模型對照組縮小(P<0.05或P<0.01)?；钛?lián)合外周血干細胞移植可顯著增加潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達，增加局部潰瘍組織CD38、CD34、CD44蛋白表達，促進新生血管形成及潰瘍創(chuàng)面的愈合。

中醫(yī)學(xué)認為：由于瘀阻于四肢脈絡(luò)，氣血不能濡養(yǎng)肌肉筋骨而出現(xiàn)肢體麻疼或肢端壞疽?；钛窃谥嗅t(yī)藥理論指導(dǎo)下、結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究篩選而成的治療糖尿病足的中藥方劑。方中丹參、紅花、赤芍具有活血化瘀、止痛通絡(luò)作用；乳香善于調(diào)氣，能活血定痛，消腫生??；川芎具有祛風(fēng)、止痛活血行氣的功效；生黃芪、黨參、生地黃具有養(yǎng)血生津、活血行氣止痛作用，其中黨參益氣養(yǎng)血生津，生黃芪益氣固表、利水、排膿生肌、托瘡，生地黃滋陰清熱；黃柏清熱解毒，瀉火燥濕；大黃瀉火解毒、活血祛瘀。全方共奏通絡(luò)止痛、活血祛瘀、解毒生肌、益氣生津之效。本研究通過灌胃大鼠、調(diào)節(jié)機體而發(fā)揮上述作用，證實了活血生肌湯對干細胞移植治療糖尿病足具有增強療效的作用，此與該方具有清熱解毒、活血行氣止痛通絡(luò)、祛瘀生新的功效有關(guān)，其可促進干細胞移植后血管新生，促進側(cè)支循環(huán)的建立，但其作用機制有待深入研究。

[1]高延明,張路.骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病足過程中血管內(nèi)皮生長因子的表達[J].中國組織工程研究,2013,17(40):7169-7174.

[2]王瑛,但齊琴,王慶萍,等.人臍帶間充質(zhì)干細胞治療大鼠糖尿病神經(jīng)性足潰瘍的療效及VEGF表達變化[J].四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,45(1):29-33.

[3]張瑩，王偉靈，楊沁彤，等. 血清VCAM-1、FGF2等炎癥因子與難愈性糖尿病足的相關(guān)性研究[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2014,29(5):472-476

[4]萬妍,楊燕京,李玉桑,等.三黃生膚油對糖尿病大鼠末梢循環(huán)障礙和足潰瘍的作用及其機制[J].中華燒傷雜志,2016,32(3):168-175.

[5]BOLTON LL. Quality Randomized Clinical Trials of Topical Diabetic Foot Ulcer Healing Agents[J]. Adv Wound Care (New Rochelle), 2016, 5(3):137-147

[6]SNYDER RJ ,SHIMOZAKI K,TALLIS A,et al. A Prospective, Randomized, Multicenter, Controlled Evaluation of the Use of Dehydrated Amniotic Membrane Allograft Compared to Standard of Care for the Closure of Chronic Diabetic Foot Ulcer[J]. Wounds A Compendium of Clinical Research & Practice, 2016,28(3):70-77

[7]顧萍，王堅. 糖尿病足潰瘍內(nèi)科治療進展[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2009，12(11)：1019-1021

[8]段旭東,張雅蘭,趙輝,等.清利活血湯配合三黃生肌紗條對糖尿病潰瘍大鼠肉芽組織中白介素1、內(nèi)皮素1及堿性成纖維細胞生長因子含量的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2013,33(4):839-841.

[9]李友山,楊博華,冀凌云,等.中藥“蚓黃散”對大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面形態(tài)及促愈因子的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2016,9(1):10-14.