劉 峰， 張春霞， 張 莉， 于云英

勝利油田中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，東營(yíng) 257000

宮頸癌是我國(guó)女性高發(fā)惡性腫瘤之一，預(yù)后差且近年來呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染明顯相關(guān)，機(jī)體感染HPV后宮頸上皮可發(fā)生明顯惡性變，并逐漸由癌前病變轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤[2]。早期診斷和篩查HPV感染對(duì)預(yù)防和早期診治宮頸癌具有重要意義。因此，本研究通過檢測(cè)宮頸癌及癌前病變組織Ki-67、多重腫瘤抑制基因P16蛋白的表達(dá)差異，探討二者對(duì)宮頸癌及癌前病變的鑒別診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2016年8月我院收治的90例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和40例宮頸癌患者作為研究對(duì)象，選取患者的活檢病理組織標(biāo)本及其一般臨床資料進(jìn)行回顧性分析。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有宮頸癌及CIN患者均經(jīng)病理確診；初次原發(fā)病例；術(shù)前均未行放療、化療、藥物治療或其他內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性感染；肝、腎、肺等嚴(yán)重器質(zhì)性病變；非原發(fā)初診；合并其他部位惡性腫瘤。患者術(shù)后均根據(jù)實(shí)際情況給予相應(yīng)的對(duì)癥治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有入選患者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色測(cè)定Ki-67、P16蛋白表達(dá) 活檢病理組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟切片處理，對(duì)所有切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，染色前1 d進(jìn)行脫蠟處理，抗原修復(fù)切片后采用75%、85%、90%和100%梯度乙醇水化，室溫下3%雙氧水浸潤(rùn)10 min，自來水流動(dòng)沖洗3 min，然后采用純血清封閉12 h，滴加兔抗人Ki-67、P16多克隆抗體一抗(凍干粉型，0.1 mL，美國(guó)Santa Cruz公司)后置于4℃孵育過夜。次日PBS沖洗后滴加兔抗人Ki-67、P16多克隆抗體二抗(凍干粉型，0.1 mL，美國(guó)Santa Cruz公司)，37℃恒溫孵育60 min，PBS沖洗后加DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，鏡下觀察。陰性對(duì)照采用PBS處理代替一抗[3]。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用雙盲法判讀并記錄染色結(jié)果，所有切片均經(jīng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家單獨(dú)讀片判斷。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡(×400)視野進(jìn)行結(jié)果觀察，根據(jù)細(xì)胞及其標(biāo)志物染色強(qiáng)度和著色率進(jìn)行計(jì)數(shù)分析[4]。Ki-67表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：視野內(nèi)無陽性細(xì)胞表達(dá)為陰性；陽性細(xì)胞分布少于視野1/3為低表達(dá)；陽性細(xì)胞分布占視野1/3～2/3為中等表達(dá)；陽性細(xì)胞分布占視野2/3以上為高表達(dá)，中等表達(dá)及以上為陽性表達(dá)[5]。P16表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：視野內(nèi)無陽性細(xì)胞表達(dá)為陰性；陽性細(xì)胞分布不足視野25%為弱陽性；陽性細(xì)胞分布多于視野25%為強(qiáng)陽性[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊則應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者基線資料及人口學(xué)特征的對(duì)比 40例宮頸癌患者年齡25～82歲，平均(53.24±4.53)歲。90例CIN患者年齡23～81歲，平均(52.46±4.26)歲。兩組患者基線資料及既往史、妊娠史、過敏史、手術(shù)史等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

2.2 兩組患者病變組織Ki-67、P16蛋白的表達(dá)差異 結(jié)果(圖1、表1)表明：Ki-67和P16蛋白在宮頸癌及CIN病變組織中均有一定程度的表達(dá)。CIN組織Ki-67蛋白陽性表達(dá)率隨病理分級(jí)的增高而明顯升高，高級(jí)別CIN組織Ki-67陽性表達(dá)率明顯高于低級(jí)別CIN(P<0.05)；宮頸癌組織Ki-67蛋白陽性表達(dá)率明顯高于CIN病變組織(P<0.05)。

CIN組織P16蛋白呈陰性或局灶性表達(dá)，低級(jí)別CIN組織P16陽性表達(dá)率明顯低于高級(jí)別CIN組織；宮頸癌組織P16蛋白陽性表達(dá)率高于CIN組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 免疫組化染色測(cè)定宮頸癌及CIN組織Ki-67、P16蛋白的表達(dá)

A: 低級(jí)別CIN組織Ki-67蛋白的表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核；B:高級(jí)別CIN組織Ki-67蛋白的表達(dá)；C:宮頸癌組織Ki-67的表達(dá)；D: 低級(jí)別CIN組織P16的表達(dá)；E: 高級(jí)別CIN 組織P16蛋白的表達(dá)；F: 宮頸癌組織P16蛋白的表達(dá). Original magnification： ×400

表1 宮頸癌及癌前病變組織Ki-67、P16蛋白的表達(dá) n(%)

2.3 Ki-67、P16蛋白表達(dá)對(duì)宮頸癌、癌前病變的鑒別診斷價(jià)值 結(jié)果(表2)表明：Ki-67蛋白表達(dá)水平鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性和特異性分別為0%、91.11%，P16蛋白表達(dá)水平鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性和特異性分別為27.27%、100.0%。P16蛋白表達(dá)水平鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性顯著高于Ki-67，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Ki-67蛋白表達(dá)水平在區(qū)分低級(jí)別CIN與高級(jí)別CIN診斷的敏感性和特異性均為100.0%，P16蛋白表達(dá)水平在區(qū)分低級(jí)別CIN與高級(jí)別CIN診斷的敏感性和特異性分別為84.21%、80.00%，明顯低于Ki-67蛋白，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)意義。Ki-67、P16蛋白聯(lián)合鑒別診斷宮頸癌與CIN的敏感性明顯優(yōu)于單獨(dú)診斷(P<0.05)，聯(lián)合診斷在區(qū)分低級(jí)別CIN與高級(jí)別CIN的敏感性也明顯優(yōu)于單獨(dú)診斷(P<0.05)。

表2 Ki-67、P16蛋白表達(dá)在宮頸癌及癌前病變的鑒別診斷價(jià)值 %

3 討 論

Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，正常生理狀態(tài)下可在細(xì)胞周期的各個(gè)階段表達(dá)，在異常的有絲分裂中，Ki-67呈明顯的高表達(dá)[7]。機(jī)體Ki-67蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞群體的增殖能力明顯相關(guān)，可反映正常生理情況下細(xì)胞的增殖活性，對(duì)判斷病理情況下腫瘤細(xì)胞的異常激活及有絲分裂進(jìn)程也具有一定的輔助作用[7]，被認(rèn)為是宮頸上皮細(xì)胞鱗狀分化及異常增殖的特異性標(biāo)志物之一[8]。Ki-67蛋白除在正常宮頸鱗狀上皮基底層表達(dá)外，在良性反應(yīng)性增生與CIN病變中也有一定的表達(dá)。因此，在鑒別宮頸增生性病變時(shí)將其與其他抗體聯(lián)合使用可提高診斷的特異性和敏感性。

P16又稱多重腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1,MTS1)，是一個(gè)發(fā)現(xiàn)較早的抑癌基因，對(duì)多種腫瘤的轉(zhuǎn)移有抑制作用，可與細(xì)胞周期蛋白D1發(fā)生特異性結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制相關(guān)復(fù)合物的蛋白活性，阻斷正常的細(xì)胞周期進(jìn)程，與Ki-67共同參與細(xì)胞周期活動(dòng)的調(diào)節(jié)[9]。宮頸癌前病變的診斷中P16強(qiáng)陽性提示宮頸有高度鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變或?qū)m頸癌的可能。P16在永生化的宮頸上皮細(xì)胞株中呈明顯高表達(dá)，且在感染HPV的早期宮頸上皮細(xì)胞中即可檢測(cè)到明顯的P16異常表達(dá)，提示其對(duì)宮頸病變的早期診斷具有輔助價(jià)值[10]。

本研究結(jié)果表明，高級(jí)別CIN組織Ki-67蛋白陽性表達(dá)率明顯高于低級(jí)別CIN(P<0.05)，宮頸癌組織Ki-67蛋白陽性表達(dá)率明顯高于CIN組織(P<0.05)；高級(jí)別CIN組織P16蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于低級(jí)別CIN(P<0.05)，宮頸癌組織P16蛋白表達(dá)高于CIN組織(P<0.05)。P16在鑒別CIN和宮頸癌的敏感性高于Ki-67(P<0.05)，提示隨著宮頸癌前病變級(jí)別的增高，P16表達(dá)強(qiáng)度明顯增加。Ki-67和P16聯(lián)合診斷在區(qū)分CIN和宮頸癌及低級(jí)別CIN與高級(jí)別CIN的敏感性均明顯優(yōu)于單獨(dú)診斷(P<0.05)。因此，在宮頸細(xì)胞學(xué)中聯(lián)合檢測(cè)P16、Ki-67蛋白表達(dá)可以發(fā)現(xiàn)更多的高危病例，有利于減少患者的過度創(chuàng)傷性診治，降低漏診率。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Ki-67、P16的聯(lián)合診斷能明顯提高不同組織學(xué)分級(jí)CIN與宮頸癌的診斷敏感性，但相關(guān)結(jié)論仍有待進(jìn)一步的大樣本研究證實(shí)。

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