吳 娟 邱綺虹 楊驥鋒 梁 敏

慢性牙周炎是口腔科常見疾病之一，牙槽骨破壞是其重要病理特征，最終導(dǎo)致牙松動(dòng)、脫落。局部菌斑微生物是牙周炎的始動(dòng)因子，而全身性因素如糖尿病、代謝綜合征等系統(tǒng)疾病可促進(jìn)牙周炎發(fā)展[1,2]。近年來研究表明，代謝綜合征可加重牙周炎癥狀，增加失牙風(fēng)險(xiǎn)[3-6]。代謝綜合征以腹型肥胖、高血壓及糖脂代謝紊亂為特征，糖脂代謝紊亂常誘發(fā)高血糖高血脂[7]。Gong等發(fā)現(xiàn)高糖高脂通過抑制成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，削弱成骨細(xì)胞分化能力[8,9]，并增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨吸收水平[10]。健康牙周狀況下，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收處于平衡狀態(tài)，維持牙槽骨的正常形態(tài)與功能。在實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型中，成骨細(xì)胞凋亡增多導(dǎo)致新骨形成減少，影響牙槽骨的修復(fù)重建，加重牙槽骨缺失及牙周炎病情[11]。高糖高脂條件下，胰島β細(xì)胞、心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性下降，凋亡增加[12-15]，但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，高糖高脂是否影響成骨細(xì)胞增殖及凋亡。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖高脂引起成骨細(xì)胞正常形態(tài)的改變，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究高糖高脂對(duì)成骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為探討代謝綜合征促進(jìn)牙周炎癥加重的可能原因提供新思路。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 棕櫚酸(PA)粉末(MPBiomedicals，美國(guó))，D-葡萄糖(Sigma,美國(guó))，小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1 Subclone 14，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供)，胎牛血清(Gibco，美國(guó))，青霉素鏈霉素雙抗(Gibco，美國(guó))，α-MEM培養(yǎng)基(含D-glucose5.6mM，Gibco，美國(guó))，CCK-8(Dojindo，日本)，Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(Biosciences，美國(guó))，RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、小鼠β-actin一抗及氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(上海碧云天)，小鼠cleaved caspase-3、caspase-3一抗(Cell Signaling Technology，美國(guó))。

1.2 高糖高脂溶液的配置 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，研究者通常采用11mM-30mM糖濃度及或0.4mM棕櫚酸處理肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等，構(gòu)建代謝綜合征高糖高脂細(xì)胞模型[16-19]。稱量棕櫚酸(PA)粉末及NaOH共同溶于雙蒸水，使NaOH終濃度為0.01M，棕櫚酸終濃度為20.0mM，混勻后于70℃水浴30min得到PA/NaOH溶液。配置30%BSA溶液(w/v，溶于PBS)，按照BSA溶液和PA/NaOH溶液的體積比為33∶40混合得到PA/BSA的穩(wěn)定儲(chǔ)備液，存放于-20℃[20]。使用時(shí)，每2ml完全培養(yǎng)基加入5.2mg的D-glucose及73uL的PA/BSA儲(chǔ)存液，0.22μm濾器除菌，最終得到D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%的高糖高脂溶液。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 成骨細(xì)胞MC3T3-E1在含有10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合后傳代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組使用含D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%的高糖高脂溶液，對(duì)照組使用含0.5%BSA的完全培養(yǎng)基(含D-glucose5.6mM)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)組(D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%)及對(duì)照組(D-glucose 5.6mM，BSA 0.5%)細(xì)胞培養(yǎng)24h、36h、48h后，分別在倒置相差顯微鏡(Axiovert 40,美國(guó))下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 成骨細(xì)胞以1500個(gè)/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24h后加入完全培養(yǎng)基或高糖高脂溶液處理0、12、24、36、48h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔100ul培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基和CCK-8按照體積比9∶1混合，去除處理液后每孔加入CCK-8混合液100uL，37℃避光孵育2h，450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 Annexin V/PI雙染流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 成骨細(xì)胞以2×105個(gè)/瓶接種于25cm2培養(yǎng)瓶，每瓶3ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)36h后高糖高脂(D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%)處理細(xì)胞 0、24、30、36h，依據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書，收集細(xì)胞，用1×Binding Buffer重懸調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L，加入Annexin V和PI染液室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，凋亡率=C4早期凋亡細(xì)胞率+C2晚期凋亡細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 Western blotting檢測(cè)cleaved caspase3和caspase-3的表達(dá) 成骨細(xì)胞以2×105個(gè)/瓶接種于25cm2培養(yǎng)瓶，每瓶3ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)36h后高糖高脂(D-glucose 20mM,PA 0.4mM，BSA 0.5%)處理細(xì)胞 0、6、12、24、36h，RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)樣本蛋白濃度，按照每泳道35ug總蛋白，10%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，4℃孵育小鼠 cleaved caspase-3、caspase-3(1∶1000)及小鼠β-actin一抗(1∶1000)16至18h，常溫孵育氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(1∶1000)1h，Image Auant Las4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(GE Healthcare，瑞典)檢測(cè)，Image J軟件(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)進(jìn)行條帶灰度值檢測(cè)與分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值，其中β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(one w ay ANOVA)，LSD法進(jìn)行兩兩比較，以雙側(cè)p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 高糖高脂引起成骨細(xì)胞形態(tài)改變 倒置相差顯微鏡下觀察，對(duì)照組成骨細(xì)胞輪廓清晰，呈梭形或多角形，細(xì)胞間呈鋪路石樣緊密連接(圖1A-圖1C)。高糖高脂培養(yǎng)24h時(shí)觀察到細(xì)胞變得稀疏，形態(tài)皺縮，胞間間隙增寬，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，該現(xiàn)象更加明顯(圖1D-圖1F)，提示高糖高脂可改變成骨細(xì)胞正常形態(tài)。

2.2 高糖高脂抑制成骨細(xì)胞增殖 圖2所示，培養(yǎng)成骨細(xì)胞0、12、24、36、48h，CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞呈指數(shù)式增殖，高糖高脂組24h時(shí)吸光度值(0.065±0.013)較同時(shí)刻對(duì)照組(0.237±0.048)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F24h=24.489，P=0.001)，36、48h分別降低至0.032±0.022和0.027±0.022，與同時(shí)刻對(duì)照組相比差異更顯著(F36h=124.319，p＜0.001；F48h=272.440，p＜0.001)，提示高糖高脂呈時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖。

圖1 高糖高脂處理24、36、48h后成骨細(xì)胞的形態(tài)變化

圖2 高糖高脂處理成骨細(xì)胞0-48h后的增殖活性

2.3 高糖高脂促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡 高糖高脂處理成骨細(xì)胞0、24、30、36h后，Annexin V/PI雙染流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，凋亡率=C4早期凋亡細(xì)胞率+C2晚期凋亡細(xì)胞率(圖3A)。圖3B所示，高糖高脂組24h時(shí)凋亡率(9.68%±3.33%)與對(duì)照組(1.96%±1.32%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.274，P=0.022)，36h時(shí)凋亡率(12.89%±3.40%)上升至對(duì)照組6.6倍(P=0.004)，提示高糖高脂呈時(shí)間依賴性促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。

圖3 高糖高脂培養(yǎng)0-36h后成骨細(xì)胞凋亡情況

2.4 高糖高脂上調(diào)cleaved caspase-3蛋白水平 Western blotting結(jié)果顯示，健康成骨細(xì)胞表達(dá)caspase-3，在相對(duì)分子量為35k Da處可見清晰條帶，但極少表達(dá)活化的cleaved caspase-3；高糖高脂時(shí)間依賴性上調(diào)cleaved caspase-3蛋白水平，在17k Da處可見逐漸增強(qiáng)的條帶，caspase-3蛋白水平不變(圖4A)。圖4B所示，高糖高脂處理成骨細(xì)胞24h后，cleaved caspase-3相對(duì)表達(dá)量(0.349±0.068)較對(duì)照組(0.146±0.033)升高約2.4倍(F=9.603，P=0.016)，36h時(shí)蛋白水平(0.468±0.136)約為對(duì)照組的3.2倍，差異更顯著(F=9.603，P=0.001)，提示高糖高脂呈時(shí)間依賴性上調(diào)cleaved caspase-3表達(dá),與細(xì)胞凋亡相呼應(yīng)。

圖4 高糖高脂處理成骨細(xì)胞0-36h后caspase-3、cleaved caspase-3蛋白水平

3.討論

大量研究表明，代謝綜合征與牙周炎相互影響。Iwasaki等發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征可增加牙周炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]。高密度脂蛋白膽固醇降低、空腹血糖升高及腹部肥胖這三項(xiàng)危險(xiǎn)因素與牙周疾病密切相關(guān)，牙周炎患者合并有代謝綜合征時(shí)，牙周袋加深，附著喪失加重[3]。同時(shí)，牙周健康狀況與代謝綜合征的發(fā)生相關(guān)。縱向觀察顯示，深牙周袋患者有更高幾率出現(xiàn)代謝綜合征臨床癥狀[21]。維持良好的口腔衛(wèi)生有助于降低罹患代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[22]。因此，探討代謝綜合征與牙周疾病關(guān)系的機(jī)制具有臨床價(jià)值。

糖脂代謝紊亂是代謝綜合征的重要臨床特征，表現(xiàn)為高糖高脂血癥[7]。高血脂最常見類型是總甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平升高，伴高密度脂蛋白膽固醇水平下降[23]，其中引起細(xì)胞毒性的脂質(zhì)有甘油三酯、游離膽固醇、游離脂肪酸等。代謝綜合征患者靜脈血游離脂肪酸濃度為(0.40±0.10)mM[24]，棕櫚酸屬于游離飽和脂肪酸，體外實(shí)驗(yàn)常用0.4mM棕櫚酸作為高脂培養(yǎng)條件[15,16,25]。Ying等發(fā)現(xiàn)0.4mM棕櫚酸作用心肌細(xì)胞24h后細(xì)胞增殖活性受抑制，凋亡率上升[25]。臨床上暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道齦溝液中游離脂肪酸的濃度，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)齦溝液中可檢測(cè)到載脂蛋白B，其濃度約為靜脈血的25倍[26]，載脂蛋白B是低密度脂蛋白膽固醇的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它的測(cè)定可直接反應(yīng)低密度脂蛋白膽固醇的水平。研究表明，齦溝探診出血及指尖采血的血糖濃度在個(gè)體內(nèi)均有高度相關(guān)性，提示口腔微環(huán)境與全血血糖濃度相近[27]。體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建高糖細(xì)胞模型時(shí)常采用11mM-30mM糖濃度，研究高糖環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、成骨細(xì)胞等的作用[12,17,18,28,29]。Sidarala等發(fā)現(xiàn)20.0mM葡萄糖可激活胰島β細(xì)胞線粒體凋亡通路[28]。

我們發(fā)現(xiàn)20.0mM葡萄糖及0.4mM棕櫚酸培養(yǎng)成骨細(xì)胞24h時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮、脫落，胞間間隙增寬，此時(shí)細(xì)胞增殖活性較同時(shí)刻對(duì)照組降低(F24h=24.489，P=0.001)，凋亡率上升至對(duì)照組的5倍(F=6.274，P=0.022)，且高糖高脂對(duì)成骨細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的促進(jìn)呈時(shí)間依賴性。高糖高脂可影響細(xì)胞多種生物學(xué)特性，如增殖、凋亡、細(xì)胞形態(tài)等。胰島β細(xì)胞在高糖高脂作用下，細(xì)胞周期抑制劑p16、p18表達(dá)增加，阻礙D-cyclins調(diào)控作用，細(xì)胞增殖能力下降[15]；且高糖高脂可促進(jìn)胰島β細(xì)胞釋放ATP，ATP在胞外降解為ADP并與嘌呤能受體P2Y13結(jié)合，活化caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。Caspase-3是凋亡通路中關(guān)鍵蛋白，經(jīng)上游蛋白酶剪切為cleaved caspase-3活化，可降解細(xì)胞骨架蛋白、核蛋白等，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，還可降解MEK激酶、PKA2促進(jìn)凋亡[31]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖高脂處理成骨細(xì)胞24h后，cleaved caspase-3蛋白水平顯著增高，且相對(duì)表達(dá)量呈時(shí)間依賴性上調(diào)，與凋亡吻合。Pacios等在大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型中發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞凋亡增加導(dǎo)致新骨形成減少，使用半胱天冬酶-3(caspase-3)抑制劑可減少成骨細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新骨形成，說明cleaved caspase-3參與成骨細(xì)胞的凋亡過程[11]。

綜合我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果及前人研究，顯示高糖高脂從多個(gè)方面影響骨組織的改建，表現(xiàn)為：①高糖高脂呈時(shí)間依賴性抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，引起細(xì)胞數(shù)量減少；②成骨細(xì)胞在高糖高脂環(huán)境中堿性磷酸酶活性下降，Runx2、COL1α的mRNA及蛋白水平下調(diào)，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少，成骨能力減弱[8,9]；③高糖或高脂可增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨吸收水平[10]。綜上，高糖高脂通過減少成骨細(xì)胞數(shù)量、削弱成骨分化能力、提高破骨吸收水平，打破骨形成與吸收的平衡狀態(tài)，影響牙槽骨的修復(fù)重建，可能是代謝綜合征加重牙周炎癥的原因之一。探討高糖高脂環(huán)境下保護(hù)成骨細(xì)胞的有效方法，并促進(jìn)成骨分化及抑制破骨細(xì)胞骨吸收，對(duì)臨床治療牙周炎有重要意義。

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