王瑩瑩,董 浩,張馮江,王福園,陳 璟,陳首名,嚴(yán) 敏,陳 星

(浙江大學(xué)生物傳感器國家專業(yè)實驗室,生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室,生儀學(xué)院,杭州 310027)

氯胺酮(ketamine),全名為2-鄰-氯苯基-2-甲氨基環(huán)已酮,是苯環(huán)已哌啶(PCP)的衍生物。因為其物理形狀通常呈白色粉末,而英文名稱的第1個字母是K,故俗稱“K”粉。氯胺酮為非競爭性NMDA受體阻斷劑,目前在醫(yī)學(xué)臨床上一般用于小兒外科手術(shù)的麻醉[1];但是近年來,由于其具有一定的致幻作用而被濫用于各種娛樂場所,在各個城市中的一些娛樂場所氯胺酮的濫用問題嚴(yán)重,是目前藥物濫用中的一個新問題[2]。

一般氯胺酮的攝取方法有鼻吸和靜脈注射,氯胺酮進(jìn)入人體后主要代謝為去甲氯胺酮和脫氫去甲氯胺酮[3];有研究表明,在單劑量給氯胺酮后,72 h內(nèi)從尿樣中排出的藥物中,約有2.3%的原體藥物、1.6%的去甲氯胺酮、16.2%的脫氫去甲氯胺酮[4]。因此如何能夠快速準(zhǔn)確檢測尿液等生物檢材中氯胺酮及其兩種主要代謝物成為氯胺酮毒品檢測中的首要問題。

氯胺酮檢測的傳統(tǒng)方法主要包括薄層色譜分析法(TLC)、氣相色譜(GC)及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)(UPT-LF)等[5]。其中TLC色譜操作繁瑣,需時較長[6];GC及GC-MS需要一定的衍生化處理[7];HPLC在實驗中需要消耗大量的有機試劑,對于有些分子量較大的物質(zhì),難以分離[8];CE克服了GC和HPLC的一部分缺點,分離度高、低成本,但也需較復(fù)雜的樣品前處理[9];而ELISA及UPT-LF測試需要制作免疫層析試紙,操作復(fù)雜,常常出現(xiàn)假陽性,需進(jìn)一步分析確證[10]。

圖1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及實物圖

本文針對現(xiàn)有檢測方法的不足,介紹一種基于超聲霧化,快速氣相色譜和聲表面波傳感器聯(lián)用的快速、簡便檢測尿液中氯胺酮的方法,此方法樣品前處理簡單,可在1 min內(nèi)完成氯胺酮的快速檢測,適合毒品檢測中一些特定場合氯胺酮的快檢。本系統(tǒng)創(chuàng)新點在于用超聲霧化技術(shù)處理氯胺酮樣品,突破了傳統(tǒng)復(fù)雜樣品前處理技術(shù)時間及技術(shù)上的局限,縮短了氯胺酮檢測時間,并在特異性和靈敏度上滿足使用要求。

1 系統(tǒng)和方法

1.1 硬件系統(tǒng)設(shè)計

本系統(tǒng)通過超聲霧化裝置,氣相色譜及聲表面波傳感器結(jié)合的方式,實現(xiàn)對溶液中氯胺酮的快速檢測,系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖如圖1(a)所示,主要由霧化裝置,六通閥,金屬毛細(xì)管柱,聲表面波傳感器以及顯示器組成。其中,霧化裝置將待測樣品由液體轉(zhuǎn)換為氣霧均勻分布于霧化裝置的腔體中。霧化裝置結(jié)構(gòu)圖如圖1(c)所示,主要由霧化腔體,超聲霧化片,霧化電路板,進(jìn)樣口等構(gòu)成,通過調(diào)整霧化電路板參數(shù),控制超聲霧化片霧化功率,在霧化腔體中形成濃度恒定的氣霧態(tài)樣品,從進(jìn)樣口中通過載氣氦氣進(jìn)入金屬毛細(xì)管柱進(jìn)行分離,實物圖如圖1(d)所示。實驗過程中通過控制六通閥實現(xiàn)進(jìn)樣和分析兩種狀態(tài),在進(jìn)樣狀態(tài)下,氣霧樣品從進(jìn)樣口抽入,吸附于Tenex TA吸附管;在分析狀態(tài)下,Tenex TA吸附管被瞬間加熱,在載氣氦氣的作用下,待測樣品被吹出,進(jìn)入金屬毛細(xì)管柱進(jìn)行分離,先后進(jìn)入傳感器氣室進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果將通過計算機分析顯示[11],本系統(tǒng)實物圖如圖1(b)所示。

1.1.1 霧化裝置

在檢測開始,首先需要將待檢測的液體樣品通過霧化裝置轉(zhuǎn)化為可被抽入檢測的氣霧態(tài)。霧化裝置包括霧化執(zhí)行器件,霧化電路,進(jìn)樣口以及霧化腔體,本系統(tǒng)所用霧化執(zhí)行器件為超聲霧化片,霧化裝置的結(jié)構(gòu)如圖1(c)、圖1(d)為霧化裝置實物圖。

本系統(tǒng)所用的超聲霧化片,利用電子高頻振蕩,將液體的結(jié)構(gòu)打散形成氣霧態(tài),可將原本不易揮發(fā)的液體霧化形成一定濃度氣霧狀。霧化電路通過調(diào)節(jié)電壓可控制輸出的諧振功率,從而達(dá)到控制霧化速度的作用。液體樣品經(jīng)過霧化執(zhí)行器件霧化后將從下方小孔進(jìn)入霧化腔體,霧化腔體的結(jié)構(gòu)適合氣體的流動,一段時間后,將在霧化腔體形成流速恒定的氣霧狀樣品。當(dāng)通過霧化控制器件設(shè)置電壓恒定時,霧化腔體內(nèi)的樣品濃度與所用液體樣品濃度呈函數(shù)關(guān)系。霧化裝置側(cè)面有進(jìn)樣孔,將進(jìn)樣針插入一定深度便可用于樣品的進(jìn)樣。在進(jìn)樣孔對面設(shè)計有抽氣接口,在一次檢測完成后,啟動抽氣泵抽氣20 s,抽出腔體中的殘余樣品。

1.1.2 快速氣相色譜及聲表面波傳感器部分

待測液體樣品經(jīng)過霧化裝置的霧化作用,在霧化腔體中形成流速恒定的氣霧態(tài)樣品后,經(jīng)過載氣氦氣導(dǎo)入快速氣相色譜及聲表面波傳感器部分進(jìn)行分離及檢測。該部分包括用于控制氣路狀態(tài)的六通閥,用于對物質(zhì)進(jìn)行吸附的內(nèi)填Tenax TA多孔聚合物材料的吸附管,GC金屬毛細(xì)管柱以及聲表面波傳感器氣室等;通過六通閥改變氣路連接可將系統(tǒng)工作分為物質(zhì)富集及檢測兩個階段;在物質(zhì)富集階段,氣泵從進(jìn)樣口抽氣,氣霧態(tài)樣品進(jìn)入Tenax TA吸附管進(jìn)行富集,吸附過程結(jié)束后,通過控制六通閥轉(zhuǎn)向,進(jìn)入檢測階段。在檢測階段,為了保證樣品幾乎同時進(jìn)入GC金屬毛細(xì)管柱,降低分離誤差,對吸附管在50 ms內(nèi)加高溫到約250 ℃,將吸附物脫附,在載氣吹掃下,脫附的混合物進(jìn)入GC金屬毛細(xì)管柱分離,最后分離出的物質(zhì)在聲表面波傳感器上進(jìn)行檢測[12]。最終的物質(zhì)曲線橫軸為保留時間,代表不同物質(zhì),縱軸為聲表面波傳感器響應(yīng)頻率,代表每種物質(zhì)的質(zhì)量。

氣相色譜采用直熱式毛細(xì)管柱加熱方式,通過直接在毛細(xì)管柱兩端加電壓進(jìn)行加熱,毛細(xì)管柱為石英材料,外套金屬管,對金屬管進(jìn)行直流電加熱,并利用溫度傳感器進(jìn)行溫度反饋控制。Tenax TA吸附管對物質(zhì)的富集作用可大大提高了傳感器的檢測下限,并且可以消除一些高揮發(fā)性氣體及永久氣體如O2,N2,H2,He等的影響,提高檢測效率[13]。聲表面波器件的一個顯著特點是聲表面波在晶體表面?zhèn)鞑r,聲表面波器件本身頻率相位等參數(shù)易受到外界條件影響而發(fā)生變化,常利用此特點進(jìn)行氣體物質(zhì)的檢測,如聲表面波瓦斯傳感器對甲烷氣體的檢測[14],本文利用此特點進(jìn)行溶液中氯胺酮的物質(zhì)檢測[15]。

本部分基于氣相色譜分離,可以使待檢測的物質(zhì)獨立于其他干擾物質(zhì),具有較高的特異性。本系統(tǒng)使用的聲表面波傳感器為36 ℃ Y-X切型石英,中心頻率500 MHz,當(dāng)傳感器上有物質(zhì)沉積時,傳感器震蕩頻率發(fā)生變化;為了降低檢測信號的頻率,使用參比傳感器,通過混頻器將兩個傳感器頻率進(jìn)行差頻處理,得到差頻測量曲線[16]。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品中氯胺酮檢測

1.2.1 儀器與試劑

實驗所用的霧化片為超聲波微孔霧化片,頻率108 kHz,直徑為16 mm,;系統(tǒng)所用的金屬毛細(xì)管柱型號為瑞斯泰康MXT-5;使用鹽酸氯胺酮注射液(浙江九旭)配置標(biāo)準(zhǔn)溶液,規(guī)格為10 mL:0.1 g;使用IntegraVision 功率計測量霧化裝置功率,型號為PA2201A。

1.2.2 氣相色譜條件

MXT-5金屬毛細(xì)管色譜柱長30 m,內(nèi)徑為0.25 mm,膜厚0.1 um;進(jìn)樣口,六通閥,毛細(xì)管柱,傳感器溫度分別為200 ℃、180 ℃、40 ℃、30 ℃;載氣流量為3 mL/min;色譜柱溫的初溫為40 ℃,維持1 s,然后以10 ℃/s的速率升至180 ℃;實驗室環(huán)境溫度控制在22 ℃左右。

1.2.3 氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液的配置

使用鹽酸氯胺酮注射液和純水,分別配0.1 μg/mL、0.25 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.4霧化裝置參數(shù)測量

霧化裝置工作電壓在4 V～7 V之間,使用IntegraVision功率計測量電壓在4.0 V～6.5 V之間時霧化裝置的功率,并得出功率電壓變化關(guān)系。

1.2.5實驗方法

打開儀器開關(guān),根據(jù)2.2.2小節(jié)所述氣相色譜條件設(shè)置參數(shù),開始預(yù)熱。等待儀器預(yù)熱完成后,空抽 3次消除基線。為了降低檢測下線,在測量0.1 μg/mL～12.5 μg/mL的濃度范圍時,設(shè)置抽氣時間為30 s,在測量12.5 μg/mL～150 μg/mL的濃度范圍時,設(shè)置抽氣時間為10 s。用移液管吸取所需標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液30 ml,打開霧化裝置開關(guān),滴于超聲霧化片上,開始霧化,等待5 s后霧化腔體中氣霧態(tài)樣品分布均勻,操作分析儀器開始抽氣,進(jìn)行分析。

在一次檢測完成后,空抽3次去除霧化腔體中的殘留樣品后開始下一次檢測。整個實驗過程在40 s內(nèi)完成;每個濃度的氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)液,重復(fù)測量20次。

2 實驗結(jié)果與討論

在用標(biāo)準(zhǔn)溶液實驗前,首先需要確定實驗中所使用的霧化裝置的供電電壓。圖2為實驗中所用霧化裝置的電壓功率測量曲線,當(dāng)電壓較低時,霧化裝置功率較小,霧化速率低,當(dāng)電壓逐漸增加,霧化裝置功率增加,在電壓為5 V附近,功率先升后降,在電壓為5.9 V以后,功率逐漸穩(wěn)定。

圖2 化裝置功率電壓測量曲線

當(dāng)設(shè)置霧化裝置的供電電壓為6 V時,霧化裝置功率較高,且當(dāng)電壓有微小波動時,功率維持穩(wěn)定,保證霧化裝置的霧化速率一定,因此選擇6 V為霧化裝置的供電電壓,在此電壓下,霧化裝置電流116 mA,功率0.7 W,頻率108 kHz,單位時間霧化量為450 mL/h。

使用系統(tǒng)進(jìn)行檢測,當(dāng)樣品中含有氯胺酮時,可以看到在12 s時傳感器上出現(xiàn)物質(zhì)沉積,振蕩頻率有明顯變化,如圖3(a)所示。當(dāng)繪制出傳感器響應(yīng)的差分曲線,如圖3(b)所示,可以看出在對應(yīng)位置有明顯出峰,而霧化產(chǎn)生的水氣以及其余干擾物質(zhì)如O2,N2,H2,He等對檢測結(jié)果沒有影響。其他物質(zhì)如苯環(huán)己哌啶,由于和氯胺酮分子量并不接近,通過氣相色譜可實現(xiàn)氯胺酮及苯環(huán)己哌啶等物質(zhì)的分離[17],通過與Gentili等人研究的對比,我們發(fā)現(xiàn),通過調(diào)節(jié)色譜柱膜厚、管徑、長度以及載氣流量和升溫速率等參數(shù)可以實現(xiàn)氯胺酮及苯環(huán)己哌啶等物質(zhì)的分離。

圖3 傳感器響應(yīng)曲線

圖4 氯胺酮檢測結(jié)果

將不同濃度氯胺酮樣品的檢測曲線繪制在一張圖上,如圖4(a)左圖所示,可以看出隨著樣品濃度的增加,氯胺酮峰的峰高不斷增加,峰面積不斷增大;對測量結(jié)果的平均值進(jìn)行一次曲線擬合,相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.971 9,如圖4(a)右圖所示;圖4(a)檢測所設(shè)置的抽氣時間為10 s,在氯胺酮樣品濃度低于25 μg/mL時,傳感器響應(yīng)較小,為了提高傳感器的響應(yīng),在測量濃度為0.1、0.25、1.25、2.5、5、12.5 μg/mL氯胺酮樣品時,將抽氣時間設(shè)置為30 s,檢測結(jié)果如圖4(b)所示。低濃度組氯胺酮樣品檢測結(jié)果與高濃度組相似,線性相關(guān)系數(shù)R2為0.948 1,檢出限為0.1 μg/mL。

在本次實驗中,選擇了6 V為霧化裝置的供電電壓,該電壓下,霧化裝置霧化功率較高,穩(wěn)定性良好,霧化速率高且穩(wěn)定。因為實際吸毒患者的尿液等樣本難以獲得,所以本實驗只檢測了氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液;氣相色譜利用不同物質(zhì)沸點,極性及吸附差異,可以對混合物做很好的分離,所以對于實際的生物樣本,通過本系統(tǒng),經(jīng)過氣相色譜的分離,不會對氯胺酮的測量結(jié)果有較大影響。本系統(tǒng)對氯胺酮樣品的檢出限為0.1 μg/mL,在0.1 μg/mL～150 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2在0.948 1以上,檢測特異性高,檢測所需時間短,可作為一種快速判斷樣品溶液中是否含有氯胺酮的方法完全滿足實際工作需要。

3 結(jié)論

本文提出了一種基于霧化裝置、快速氣相色譜及聲表面波傳感器聯(lián)用的氯胺酮快速檢測系統(tǒng)和方法。和傳統(tǒng)的GC,GC-MS,HPLC等檢測方法相比,本系統(tǒng)通過超聲霧化技術(shù)處理液體樣品,樣品的前處理簡單,檢測操作簡單,操作員無需專業(yè)訓(xùn)練,而且從開始檢測到得到結(jié)論可在1 min之內(nèi)完成,檢測結(jié)果線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2在0.948 1以上,檢出限為0.1 μg/mL,不失為一種可以快速檢測溶液中是否含有氯胺酮的方法,用于現(xiàn)場氯胺酮的快速檢測。

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