陳 嶺,雷 鳴，張德鎖，3

( 1.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作江蘇中心，江蘇 蘇州 215163; 2.蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215021; 3. 現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室(蘇州)，江蘇 蘇州 215123)

蠶絲是一種天然蛋白質(zhì)纖維，自古以來一直是高檔紡織品的原料，具有“纖維皇后”的美譽[1]。絲素蛋白是蠶絲的主要組成和利用部分，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸構(gòu)成，具有優(yōu)異的力學(xué)性能，良好的生物相容性和生物降解性等特性，在生物醫(yī)用領(lǐng)域表現(xiàn)出獨特的研究開發(fā)和應(yīng)用潛力[2]。目前，已利用絲素材料開發(fā)研究了多種形式的生物醫(yī)用材料，如絲素蛋白膜、多孔支架、納米纖維網(wǎng)、水凝膠等，在人工皮膚、人工韌帶、骨再生、生物傳感器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[3-5]。

利用絲素材料制備的蛋白微球不僅具有生物相容性好、比表面積大、分散性好、生物降解快的特點，同時其流動和擴散性能佳，是藥物傳輸、藥物緩釋、酶固定劑、靶向治療的良好載體[6]。目前，制備絲素蛋白微球的方法主要有自組裝法、乳化法、鹽析法、噴霧干燥法、高壓靜電分化法等[7]。這些方法制備的蛋白微球往往存在顆粒大小不均勻、粒徑分布廣，或者工藝復(fù)雜、制備周期長等缺點[8]。微流體控制技術(shù)是利用微流控裝置中的微通道系統(tǒng)來達(dá)到控制微尺度液體的一種技術(shù)[9]。其具有以下優(yōu)點：微球大小易于控制，粒徑均一，單分散性高；易于控制制備不同結(jié)構(gòu)的微球；完全無毒、無污染；自動化程度高，操作簡便。

本研究自主設(shè)計了制備絲素蛋白微球的微流體控制裝置，并通過微流體控制技術(shù)操縱互不相溶的兩相流體，制備尺度均一、結(jié)構(gòu)可控的絲素蛋白微球。探討了絲素蛋白微球的成型原理，優(yōu)化了制備工藝，并對制備的蛋白微球進(jìn)行了表征。

1 材料與方法

1.1 絲素蛋白溶液的制備

將100g家蠶生絲置于4L濃度為0.05%的Na2CO3水溶液中，98～100°C下煮練30min，取出后在60℃的去離子水中進(jìn)行清洗，重復(fù)三次煮練和清洗操作使絲膠充分去除。60 °C恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干備用。

取10g脫膠后的絲素纖維，添加到50mL濃度為9.3mol/L的LiBr水溶液中，60°C下攪拌1.5h使其溶解。利用分子量為8～12 kDa的透析袋對上述溶解的絲素纖維進(jìn)行透析處理4天，以除去LiBr。將透析得到的絲素蛋白溶液過濾和離心處理后裝入試劑瓶中保存于4℃冰箱中備用。

所制備的絲素溶液濃度計算如下：將洗凈烘干的表面皿稱重，得到皿重W (g)。用移液槍取1mL絲素蛋白溶液滴入到表面皿中后稱重W1(g)，放入80°C烘箱中4 h后取出稱重，以后每隔20分鐘稱重一次，直到重量不再變化時記下數(shù)據(jù)為W2(g)。依據(jù)計算公式(1)計算得到絲素蛋白溶液的濃度C(%)，多次取樣稱重計算后取平均值。

(1)

1.2 絲素蛋白微球的制備

以濃度為4%～6%的絲素溶液為內(nèi)相，1%～4%濃度的Span-80液體石蠟溶液為外相，3%的戊二醛液體石蠟混合溶液為反應(yīng)相，構(gòu)建絲素微球的生成反應(yīng)系統(tǒng)?？刂七B續(xù)相與分散相的流速至連續(xù)形成穩(wěn)定的絲素乳液液滴。調(diào)節(jié)反應(yīng)相的攪拌速度為160r/min，交聯(lián)反應(yīng)2h，得到尺寸均一、結(jié)構(gòu)規(guī)則的絲素蛋白微球。

將攪拌反應(yīng)后的絲素微球進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速 6 000r/min，溫度4℃，時間15min)，去除上層石蠟混合物后加入異丙醇溶液使小球充分固化，用超聲振蕩器震蕩使異丙醇與微球顆粒充分接觸，再次離心。重復(fù)上述步驟三次后，加入去離子水并超聲震蕩，離心清洗去除表面殘留溶液與雜質(zhì)，反復(fù)進(jìn)行此步驟至少六次。將含有絲素蛋白微球的水溶液放入真空干燥箱中干燥后獲得固體絲素微球。

1.3 絲素蛋白微球的表征

(1)絲素乳液形貌的表征

取適量制得的絲素乳液于載玻片上，放置在光學(xué)顯微鏡下觀察液滴的形貌，并拍攝光學(xué)顯微鏡照片。

(2)絲素微球形貌的表征

將清洗后分散在水中的絲素微球滴加到硅片上，真空干燥后噴金90s，利用S-4800型掃描電子顯微鏡(日立，日本)，在3kV電壓、10mA電流下觀察樣品表面形貌，拍攝SEM圖片。

(3)絲素微球粒徑測試

取干燥的絲素微球樣品懸浮于去離子水中，并超聲分散，取1 mL的絲素微顆粒懸液置于樣品池中，采用激光粒度分析儀測定樣品的平均粒徑，每個樣品重復(fù)三次，并與SEM圖片進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 微流體控制技術(shù)制備絲素蛋白微球的原理

(a)原理示意圖 (b)自制實物圖圖1 微流體控制核心裝置

液滴微流控是微流控技術(shù)的一個重要分支，通過操縱互不相溶的兩相或多相流體的流動，制備單分散的單乳液、雙乳液或多乳液。通過對微流體管道結(jié)構(gòu)的獨特設(shè)計，結(jié)合注射泵或壓力系統(tǒng)控制不相溶液相的進(jìn)樣速度，利用流體間的流動剪切力、黏力和表面張力的相互作用，將連續(xù)流體分割成離散的微納米級液滴[10]。本研究為制備絲素蛋白微球，設(shè)計制備了一種同軸型微流體控制裝置(如圖1所示)，以含有Span-80的液體石蠟為連續(xù)相，絲素水溶液為分散相,利用流量泵控制兩相流體的速度。在同軸通道中，由于液體石蠟的剪切作用，得到尺寸均一的油包水乳液，并通過絲素蛋白溶液自身的粘度和石蠟中的表面活性劑作用形成穩(wěn)定的微液滴。圖2為微液滴的形成過程照片，如圖2a所示，絲素溶液從通道中擠出，在通道口聚集。隨著聚集量的增加，逐漸形成冠球狀，并在流動相的剪切作用下拉伸，并發(fā)生頸縮，如圖2b所示。隨后，脫離絲素溶液通道，形成絲素微液滴(圖2c)。

圖2 微液滴形成過程圖片

當(dāng)微液滴進(jìn)入反應(yīng)器中時，通過攪拌使微液滴充分與戊二醛接觸，戊二醛具有兩個反應(yīng)活性醛基，可以作為氨基分子的非特異性偶聯(lián)劑，與絲素蛋白分子中賴氨酸的ε-氨基、肽鏈N-端氨基、雜環(huán)上亞胺基、巰基及酰胺基團反應(yīng)發(fā)生穩(wěn)定的交聯(lián)，形成不溶于水的交聯(lián)聚合物或凝膠[11]。最后，再利用異丙醇使其充分固化，洗滌后得到尺寸均一的絲素蛋白微球。

2.2 工藝條件對成球性能的影響

為獲得穩(wěn)定的絲素蛋白微球，優(yōu)化制備工藝條件，研究探討了絲素溶液濃度和表面活性劑濃度對絲素微球成球效果的影響。

(1)絲素濃度對乳液成球效果的影響

圖3 不同絲素濃度所制備的乳液微球光學(xué)顯微鏡圖

由于絲素溶液的濃度會影響到分散相的粘度，繼而會影響到微流控成乳過程的流型[12]，因此要確定較優(yōu)的絲素溶液濃度，保證成乳過程穩(wěn)定進(jìn)行。當(dāng)表面活性劑濃度為4%時，調(diào)節(jié)絲素溶液濃度為4%、5%和6%，通過光學(xué)顯微鏡觀察所形成的乳液微球形貌如圖3所示。當(dāng)絲素濃度為4%時，由于絲素濃度較低，粘度低，內(nèi)相很容易斷裂，液滴生成速度很快，生成的乳液粒徑很小，且經(jīng)過攪拌易分散，粒徑大小不均一(如圖3a所示)；當(dāng)絲素濃度為5%時，乳液成球效果好，連續(xù)相對分散相的擠壓收縮作用明顯，液滴均勻成球，且穩(wěn)定性佳，無明顯雜球產(chǎn)生(如圖3b所示)；當(dāng)絲素濃度為6%時，乳液成球效果好，但明顯有尺寸不一的微球生成(如圖3c所示)。

(2)表面活性劑濃度對乳液成球效果的影響

圖4 不同表面活性劑濃度所制備的乳液微球光學(xué)顯微鏡圖

表面活性劑Span-80的添加是為了防止微球在收集過程中，由于時間推移或堆疊接觸時，相互之間發(fā)生融合，導(dǎo)致粒徑增大，保證絲素微球的均一性、完整性。其基本原理是通過影響兩相之間的表明張力，在二者之間形成穩(wěn)定堅實的界面膜，以此來保證絲素微球的穩(wěn)定性[13]。不同的表面活性劑濃度對兩相之間的界面張力會產(chǎn)生不同的影響，因此要確定較優(yōu)的表面活性劑濃度，保證成乳過程穩(wěn)定進(jìn)行。當(dāng)絲素溶液濃度為5%時，調(diào)節(jié)表面活性劑濃度為0%、1%、2%、3%和4%，通過光學(xué)顯微鏡觀察所形成的乳液微球形貌如圖4所示。結(jié)果表明，當(dāng)表面活性劑濃度較低時(0%、1%、2%)，無法在兩相界面之間形成界面膜，絲素溶液成乳易塌陷，無法成球或成球后易團聚(見圖4a、4b、4c)；當(dāng)表面活性劑含量為3%時，如圖4d所示，絲素溶液能夠成乳且無聚集現(xiàn)象，表面活性劑在兩相間形成界面膜，但不夠穩(wěn)定，生成的微球尺寸均勻性差；當(dāng)表面活性劑含量達(dá)到4%時，能夠在兩相間形成穩(wěn)定界面膜，乳液球形度較好，未見團聚現(xiàn)象(見圖4e)。

2.3 工藝條件對成球粒徑的影響

圖5 絲素微乳液粒徑尺寸隨內(nèi)外相流速變化關(guān)系圖

通過上述研究，我們已經(jīng)能夠制備尺寸均一、形貌規(guī)則的絲素蛋白微球，為了對所制備的微球尺寸進(jìn)行控制，需要對工藝條件進(jìn)一步探討。微球的尺寸除與內(nèi)部通道的直徑直接相關(guān)外，影響微球尺寸的主要因素還包括內(nèi)外相的流速。研究中我們探討了不同內(nèi)外相流速對成型微球粒徑的影響。首先，控制內(nèi)相流速(Qd)為1mL/h，調(diào)節(jié)外相流速(Qc)分別為40、70、100、130和160mL/h。然后，控制外相流速(Qc)為100mL/h，調(diào)節(jié)內(nèi)相流速(Qd)分別為0.5、0.75、1、1.25和1.5mL/h。利用光學(xué)顯微鏡觀察生成的絲素乳液顆粒，采用Image J軟件計算每組乳液中100個微顆粒的平均粒徑，結(jié)果如圖5所示。

從圖中可以看出，當(dāng)固定內(nèi)相的流速時，乳液液滴的尺寸隨著外相流速的增加而減小(圖5a)；而當(dāng)固定外相的流速時，乳液液滴的尺寸則隨著內(nèi)相流速的增加而增大(圖5b)，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[14]。實驗中所制備的絲素乳液液滴尺寸在150～380μm之間，經(jīng)交聯(lián)固化和干燥后所獲得的絲素蛋白微球的尺寸會相應(yīng)的縮小。

2.4 絲素蛋白微球的表征

圖6 絲素蛋白微球(a)SEM圖及其(b)粒徑分布圖

利用濃度為5%的絲素溶液，控制內(nèi)相流速1mL/h，外相流速100mL/h，制得絲素微乳液，經(jīng)交聯(lián)固化，多次洗滌并真空干燥后得到絲素蛋白微球。所制備的微球SEM圖及其粒徑分布圖如圖6所示。從圖中可以看出，絲素蛋白微球呈非常規(guī)則的球形，球體飽滿，大小尺寸均一，約5.1μm。其粒徑分布圖也顯示粒徑分布峰較窄，尺寸比較集中，峰位在5.1μm，與SEM圖結(jié)果一致。

3 結(jié)論

以濃度為5%的絲素水溶液為內(nèi)相材料，表面活性劑Span-80濃度為4%的液體石蠟為外相，通過設(shè)計制備的同軸微流控通道能夠穩(wěn)定連續(xù)地制備絲素蛋白微球。通過改變內(nèi)外相的流速可以調(diào)控所制備的絲素蛋白微球的粒徑大小。所制備的絲素蛋白微球呈規(guī)則球形，具有很好的單分散性。

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