封菊，苑中甫，邱海峰

焦作煤業(yè)（集團(tuán)）有限責(zé)任公司中央醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 焦作 454000

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的健康，近年來(lái)的發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，且發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居女性惡性腫瘤的第2位、常見(jiàn)惡性腫瘤的第4位[1]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與癌基因的抑制和抑癌基因的激活等因素有關(guān)[2]。目前，對(duì)于宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制還處于研究階段，隨著分子生物科技的發(fā)展，宮頸癌診斷和治療的研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到分子水平上[3]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種存在于細(xì)胞質(zhì)的非受體酪氨酸激酶，在多種組織中高表達(dá)且具有較高的蛋白同源性，是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵因子，在腫瘤的進(jìn)展、增殖、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[4]。據(jù)研究，F(xiàn)AK在大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、肝癌、胃癌中異常表達(dá)，與細(xì)胞的侵襲、遷移和惡性增殖有關(guān)[5-6]。但FAK在宮頸癌中的報(bào)道較少，所以本研究通過(guò)RNA干擾FAK的表達(dá)，研究其對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響以及作用機(jī)制，以期為宮頸癌的診斷、治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；FAK-pGenesil-siRNA真核表達(dá)載體由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；FAK抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）抗體、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（epithelial-cadherin，E-cadherin）抗體、β-actin抗體、鼠抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的細(xì)胞置于37℃水浴鍋中至完全溶解，加入新鮮的含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞進(jìn)行傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以每孔1×106接種于6孔板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分3組，空白對(duì)照組：Lipofectamine 2000；陰性對(duì)照組：Lipofectamine 2000，F(xiàn)AK-pGenesil-Ctrl；干擾組 ：Lipofectamine 2000，F(xiàn)AK-pGenesil-siRNA。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換含10%胎牛血清和雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的遷移、侵襲能力

實(shí)驗(yàn)前將提前配置好的Matrigel膠包被在Transwell小室基底膜的上室，37℃，30 min，紫外線照射過(guò)夜。取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h的細(xì)胞胰酶消化，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106；取200 μl細(xì)胞懸液加入已包被基底膜的小室上室中，下室中加入600 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，置于24孔板中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕拭去Matrigel膠和上室中未穿出的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，95%乙醇固定15 min，瑞士染色20 min，在倒置顯微鏡下取5個(gè)視野（上、下、左、右、中）計(jì)數(shù)，取平均數(shù)，表示細(xì)胞侵襲、遷移能力，每組3個(gè)復(fù)孔。遷移實(shí)驗(yàn)中小室上室不包被Matrigel膠，其余與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.5 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin的蛋白表達(dá)量

取各組轉(zhuǎn)染48 h的宮頸癌細(xì)胞，加入1 ml細(xì)胞裂解液和10 μl苯甲基磺酰氟（phenylemthanesulfonyl flyoride，PMSF），冰上放置30 min，在4 ℃離心機(jī)中12 000 rpm離心20 min，將上清移至干凈的Eppendorf管中，-20℃保存，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠覆蓋在電泳槽中，加入變性蛋白樣品和1×上樣緩沖液，接入電壓電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底部，終止電泳，去除濃縮膠，保留分離膠。將凝膠轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween（TBST）清洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫?fù)u床上孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。顯色液進(jìn)行顯色，反應(yīng)15 min，晾干。用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值為各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)FAK蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)情況，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組中宮頸癌細(xì)胞FAK蛋白的表達(dá)量分別為（0.735±0.082）、（0.715±0.091）、（0.362±0.049）。陰性對(duì)照組細(xì)胞中FAK蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；干擾組細(xì)胞中FAK蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖1、表1）

圖1 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)FAK蛋白表達(dá)的影響

表1 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)FAK蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P<0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

組別FAK蛋白表達(dá)量

2.2 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)其遷移能力的影響

Transwell法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株HeLa轉(zhuǎn)染48 h后遷移能力的變化。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞的遷移數(shù)分別為（142.620±15.142）、（138.643±10.275）、（45.733±3.565）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；干擾組的遷移細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)其遷移能力的影響（±s）

表2 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)其遷移能力的影響（±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P<0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

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2.3 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)其侵襲能力的影響

Transwell法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株HeLa轉(zhuǎn)染48 h后侵襲能力的變化?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞的侵襲數(shù)分別為（113.550±9.432）、（109.837±9.109）、（30.254±2.141）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；干擾組的侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表3）

表3 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)其侵襲能力的影響（±s）

表3 RNA干擾宮頸癌細(xì)胞對(duì)其侵襲能力的影響（±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P<0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

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2.4 RNA干擾對(duì)宮頸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)量的變化。陰性對(duì)照組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和E-cadherin的蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；干擾組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，E-cadherin的蛋白表達(dá)量高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖2、表4）

圖2 RNA干擾對(duì)宮頸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

表4 RNA干擾對(duì)宮頸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)量的影響（±s）

表4 RNA干擾對(duì)宮頸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)量的影響（±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P<0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

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3 討論

宮頸癌的治療一般采取手術(shù)與放化療等方式，但仍然有部分患者死于復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此需要尋找更加明確的反映宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)志物，為宮頸癌的治療方案提供合理的理論依據(jù)[7]。FAK首次發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)染的V-Src雞胚成纖維細(xì)胞中，位于人染色體8q24，相對(duì)分子質(zhì)量為125 kD，共翻譯1052個(gè)氨基酸[8]。研究報(bào)道證實(shí)，F(xiàn)AK在多種實(shí)體和非實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，參與細(xì)胞的黏附、增殖、運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)移等生命過(guò)程[9]。當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)與整合素受體群和細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)時(shí)，活化FAK，對(duì)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、遷移具有重要意義[10]。FAK可以與Src激酶形成復(fù)合物，活化促分裂素原活化蛋白激酶等下游蛋白，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、生長(zhǎng)等過(guò)程[12-13]。研究報(bào)道表明，PF-00562271、VS-4718、VS-6063等FAK抑制劑可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，因此可將FAK作為腫瘤疾病治療的分子靶點(diǎn)[14]。在宮頸癌中，F(xiàn)AK的表達(dá)量隨著宮頸癌病變臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的發(fā)展逐漸增高[15]。但關(guān)于FAK對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移及其作用機(jī)制的研究較少。本研究通過(guò)靶向FAK的siRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)FAK表達(dá)量下調(diào)可以抑制細(xì)胞的侵襲、遷移能力，所以推測(cè)FAK可能與侵襲、遷移相關(guān)蛋白作用，從而阻礙腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。

惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征為細(xì)胞的侵襲、遷移，其作用機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。研究報(bào)道顯示，惡性腫瘤侵襲、遷移的重要機(jī)制之一是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），其主要標(biāo)志是E-cadherin等上皮標(biāo)志物表達(dá)量降低[16-17]。EMT是指正常情況和病變情況下，極性上皮細(xì)胞失去極性，黏附力下降，從而極易脫離細(xì)胞群而發(fā)生侵襲、遷移[18]。在結(jié)腸癌中，F(xiàn)AK的表達(dá)量降低可使E-cadherin的表達(dá)上升并增加細(xì)胞的黏附性，抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移[19]。MMP是EMT的標(biāo)志分子，能降解細(xì)胞外機(jī)制，破壞細(xì)胞基底膜的連續(xù)性和完整性，從而引起胰腺癌、肝癌、乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[20-21]。研究表明FAK信號(hào)通路可以促進(jìn)MMP尤其是MMP-2、MMP-9的分泌，從而誘導(dǎo)血管生成、細(xì)胞浸潤(rùn)[18]。所以為了探究FAK影響宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了siRNA重組質(zhì)粒的細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)量降低，E-cadherin的表達(dá)量升高，表明FAK通過(guò)調(diào)控MMP-2、MMP-9、E-cadherin等EMT標(biāo)志物的表達(dá)量進(jìn)而影響細(xì)胞的侵襲、遷移。

綜上所述，RNA干擾FAK的表達(dá)通過(guò)影響細(xì)胞EMT過(guò)程從而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲、遷移能力，阻礙腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

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