王國(guó)慧，谷永紅，朱曬紅，付華#

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2病理科，長(zhǎng)沙 410013

人類FASCIN1基因?qū)儆趂ascin家族，其蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物是一種分子質(zhì)量為55 kD的細(xì)胞骨架蛋白，可以與F肌動(dòng)蛋白結(jié)合，定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶邊緣的絲狀偽足和微棘的核心肌動(dòng)蛋白束中[1]。細(xì)胞的絲狀偽足及微棘與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)fascin1基因表達(dá)上調(diào)引起細(xì)胞膜突起增多，細(xì)胞間連接發(fā)生解離，同時(shí)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[2]。在正常的上皮細(xì)胞中，肌成束蛋白fascin1表達(dá)缺失或較低，而在乳腺癌、肺癌和胃癌等惡性腫瘤中其表達(dá)上調(diào)[3-11]。fascin蛋白在胃癌中的高表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[9]。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中fascin1表達(dá)上調(diào)有重要的意義。Yang等[13]證實(shí)，在肺癌中fas-cin1表達(dá)上調(diào)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）的調(diào)控作用有關(guān)。然而，在胃癌中TGF-β是否也可以誘導(dǎo)fascin1表達(dá)上調(diào)，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料

人低分化胃腺癌MKN45細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。RPMI 1640培養(yǎng)基和超級(jí)小牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，脂質(zhì)體lipofectin 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白質(zhì)marker和DNA marker均購(gòu)于美國(guó)Fermentas公司，BCA Protein Assay試劑盒由美國(guó)Pierce公司提供，PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Milipore公司，fascin1抗體購(gòu)于美國(guó)Chemicon公司，SMAD2和SMAD4抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司，β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，PD98095購(gòu)于上海Promega公司，SP600125購(gòu)于上海Alexis公司，SB203580購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

2 方法

2.1 干擾小RNA的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)人SMAD2基因（BC014840）和SMAD4基因（NM005359）序列特征，依照干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）的設(shè)計(jì)原則[14]，參考葉綠等[15]和Gao等[16]的研究方法，合成針對(duì)SMAD4基因的干擾序列：5'-AAGTACTCCTTGCTGGATTGA-3'；針對(duì)SMAD2基因的干擾序列：5'-AACATTGGATGGGAGGCTTCA-3'和一條陰性對(duì)照序列發(fā)夾狀短鏈RNA（shRNA）HK（以上均由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成）。

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MKN45

參照Invitrogen公司的脂質(zhì)體（lipofectin 2000）試劑說(shuō)明書，分別將SMAD2和SMAD4的siRNA及陰性對(duì)照HK導(dǎo)入胃癌細(xì)胞系MKN45細(xì)胞中，8 h后以無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，換正常的培養(yǎng)液（含8%～10%新生牛血清）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)SMAD2、SMAD4和fascin表達(dá)

將提取的細(xì)胞總蛋白按照BCA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)總蛋白質(zhì)的濃度，取50 μg總蛋白在不連續(xù)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，以封閉液稀釋一抗（一抗工作濃度 fascin1為 1∶400，SMAD2和SMAD4均為1∶200，β-actin為1∶2000），37 ℃孵育12 h，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗膜3次，每次10 min，再用辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗1∶2000，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次10 min；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，采用Image Tool軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行校正。

2.4 細(xì)胞總RNA提取

將細(xì)胞接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，加入l ml Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)RNA在260、280 nm的吸光度比值（≥1.8）和1%瓊脂糖凝膠電泳28、18 s的RNA條帶比值（≥2.0），鑒定RNA的純度和完整性。

2.5 RT-PCR檢測(cè)與引物設(shè)計(jì)

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)SMAD2和SMAD4。取細(xì)胞總RNA 2 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μl，共30個(gè)循環(huán)。SMAD2和SMAD4的引物設(shè)計(jì)分別參照文獻(xiàn)[17]和[15]，并在基因庫(kù)上進(jìn)行核對(duì)；以基因β-actin為內(nèi)參照，β-actin的引物采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)。取PCR產(chǎn)物5 μl，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。引物序列、退火溫度和PCR產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TGF-β1對(duì)MKN45細(xì)胞fascin1表達(dá)的影響

TGF-β1處理后24、48 h，fascin1表達(dá)水平高于處理前（0 h），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖1）

圖1 TGF-β1處理前后fascin1表達(dá)變化

3.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMAD siRNA對(duì)SMAD2和SMAD4表達(dá)的影響

RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染SMAD2、SMAD4 siRNA和HK的細(xì)胞中SMAD2、SMAD4后，SMAD2、SMAD4 siRNA有效地下調(diào)了SMAD2、SMAD4表達(dá)，而HK幾乎不影響SMAD2或SMAD4表達(dá)。（圖2、圖3）

圖2 不同的轉(zhuǎn)染方式對(duì)SMAD2表達(dá)水平的影響

圖3 不同的轉(zhuǎn)染方式對(duì)SMAD4表達(dá)水平的影響

3.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMADs siRNA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)fascin1表達(dá)的影響

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMAD2、SMAD4 siRNA前后，抑制SMAD2、SMAD4表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)fascin1表達(dá)無(wú)明顯影響。（圖4）

圖4 抑制SMAD2、SMAD4表達(dá)對(duì)TGF-β1處理前后fascin1表達(dá)的影響

3.4 MAPK信號(hào)通路特異性阻斷藥對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)fascin1蛋白表達(dá)的影響

ERK和JNK信號(hào)通路的特異性阻斷藥PD98059和SP600125明顯降低了TGF-β1誘導(dǎo)的fascin1蛋白表達(dá)，而p38信號(hào)通路的特異性阻斷藥SB203580對(duì)TGF-β1處理前后MKN45細(xì)胞中fascin1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。（圖5）

圖5 ERK、JNK和p38特異性阻斷藥對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)fascin1蛋白表達(dá)的影響

4 討論

fascin是由Bryan和Kane[18]于20世紀(jì)70年代在海膽卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，因其與factin緊密結(jié)合并穩(wěn)定成束而得名?，F(xiàn)已知人fascin有3種不同的形式，即fascin1、fascin2和fascin3。研究最多的蛋白為fascin1，分布在大多數(shù)的脊椎動(dòng)物組織內(nèi)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在正常的上皮細(xì)胞中fascin1表達(dá)缺失或較低，而在許多惡性腫瘤中其表達(dá)上調(diào)[3,9-10]。Chen等[3]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸細(xì)胞中fascin1基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。另有研究顯示，在食管癌中fascin1表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的侵襲能力密切相關(guān)[10]。Xie等[19]證實(shí)，抑制fascin1表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力明顯降低。研究表明，在胃癌中fascin1表達(dá)越高，患者預(yù)后越差[9]。

Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌中TGF-β1可以促進(jìn)fascin1表達(dá)上調(diào)。本研究表明，在胃癌細(xì)胞MKN45中，TGF-β1可以誘導(dǎo)fascin1表達(dá)，且在TGFβ1作用于細(xì)胞24 h后，fascin1表達(dá)水平約為0 h的2.2倍。

TGF-β1作用廣泛，是一種多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要通過(guò)SMAD依賴途徑和SMAD非依賴途徑調(diào)控基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[20-22]。TGFβ1可以激活經(jīng)典的SMAD通路，通過(guò)TβRⅢ或直接與TβRⅡ結(jié)合[23]?；罨腡βRⅡ募集并結(jié)合TβRⅠ，使后者磷酸化?；罨腡βRⅠ分子磷酸化SMAD2、SMAD3分子并與SMAD4分子結(jié)合，形成SMAD復(fù)合物；該復(fù)合物隨即轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與各種轉(zhuǎn)錄因子相互作用以調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[24]。由此可知，SMAD復(fù)合物為該信號(hào)通路的一個(gè)中樞性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，除了由SMAD蛋白介導(dǎo)外，還有許多其他信號(hào)通路參與，其中比較重要的通路是 MAPK 通路[20-22]，包括 ERK[25]、JNK[26]和 p38 MAP激酶[27]。萬(wàn)珍玲等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌MKN45細(xì)胞中TGF-β1可以激活JNK和ERK通路。

本研究中，SMAD2和SMAD4的siRNA以及MAPK通路的特異性阻斷藥PD98059、SP600125和SB203580分別溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基的二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）中，分別以30、20、20μmol/ml的終濃度于正常的培養(yǎng)基中預(yù)孵育1 h，分別阻斷SMAD依賴途徑和SMAD非依賴途徑，檢測(cè)TGFβ1刺激24 h前后fascin1表達(dá)是否發(fā)生變化。結(jié)果表明，阻斷SMAD通路對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的fascin1表達(dá)無(wú)明顯影響，但經(jīng)ERK和JNK通路特異性阻斷藥PD98059和SP600125處理細(xì)胞后，明顯降低了TGF-β1誘導(dǎo)的fascin1基因表達(dá)水平。

綜上所述，在胃癌細(xì)胞MKN45中，TGF-β1可以經(jīng)ERK和JNK通路上調(diào)fascin1表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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